文档介绍：G0213 婴幼儿食品乳粉乳清蛋白电泳法
G_0213
婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定
本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中酪蛋白与乳清蛋白含量比率的测定。
试样用SDS-聚苯烯酰***凝胶电泳(SDS-PAGE,Laemmli法)后,用光密度计对按分子量顺序分离开的酪蛋白与乳清蛋白各谱带进行测定,求得酪蛋白与乳清蛋白的含量比率。
电泳缓冲液:将Tris (hydroxymethyl) aminomethane 、甘***酸36g、SDS ,定容至500mL。使用前以蒸馏水稀释5倍后使用;
SDS试样缓冲液: Trsi-盐酸(),体积分数20%的甘油,4%(m/V)SDS,体积分数10%2-mercaptoethanol,%的溴酚蓝(bromophnol blue);
染色剂:%考马斯蓝R-250(Coomassie brilliantblueR-250),体积分数10%的甲醇,%的乙酸;
脱色剂:体积分数10%的甲醇,%的乙酸;
酪蛋白、精制乳清蛋白(WPC);
SDS-PAGE:用梯度凝胶(10%~20%)或同效凝胶。
平板式电泳槽、供电设备、光密度计。
将试剂按蛋白质10~20μg/μL的浓度范围溶解在蒸馏水中。加入与试样同体积的SDS试样缓冲液,在煮沸热水中静置5min后,作为试样液。
使用前,酪蛋白和乳清蛋白的蛋白质浓度按凯氏(Kjeldahl)法精确测定。将酪蛋白和乳清蛋白按上述方法分别进行溶解和处理后作为标准溶液。此外,还可将酪蛋白与乳清蛋白的标准溶液按蛋白质含量的任意比率(比如蛋白质的浓度比为75∶25,50∶50,25∶75)进行混合作为混合标准溶液。
将凝胶设置在电泳槽中,加入电泳缓冲液。试样溶液与标准溶液的添加量为每孔10μL。电泳时间因电泳凝胶的种类不同而异。以10%~20%的梯度复合凝胶进行电泳时,定电流为40mA,时间为60min。电泳结束时间可按溴酚蓝的蓝谱带到达离凝胶下端5mm时为标志。电泳结束后将凝胶放入染色液中振荡染色1h,然后转入脱色液中振荡脱色12h再移到蒸馏水中。
以光密度计对带色的各谱带进行测定,求得其颜色深度(OD)的积分值(=Trace值)。
电泳后的谱带中,参照分子量以及标准酪蛋白与乳清蛋白的电泳图,分别选择以下谱带进行计算。
(1)酪蛋白:α3-酪蛋白(分子量23500),β-酪蛋白(分子量24000),κ-酪蛋白(分子量19000);
(2)乳清蛋白:α-乳白蛋白(分子量14000),β-乳球蛋白(分子量18000),血