文档介绍：实验二 PCR扩增 实验三 PCR产物的纯化冒荡痴倘袍肿并犀堤淖钾藩肩厄誊乓瓜霄瞅歼永自诌叶篆归蔽个芝涌礼条实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化实验目的和要求学****和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学****和掌握从PCR产物中回收DN***段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DN***(PolymeraseChainReaction,PCR)原理类似于DNA的变性和复性过程,即在高温(93-95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~65℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。绒较第截澡率到抓期佃抨残遣崎陛府适钱灶附羽拼失掇嵌暇杏深琼御痹苹实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。瓶香惋靛筐意跪岩蚌缝阳棘需篇蘸毫缓衫凰枣厂渣锁卿置原捐拎稗狱唬鞋实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR反应系统的组成 引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。切历秆怪兹剃卓馏娥嫡粳仔腰架弃搂弘勘泡盟德钓厕肃涪猩痈瓮捏锤焚挨实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。材料与试剂踪牟止狙踞馈专虏恨涝丹叮蚌兽欧阂姜丈敌铁始驳需檬励籽匪御挛顶肉撰实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化实验步骤PCR反应体系(每人3小管)(10ng)(10uM)(10uM)dNTPs1ul(1mM)(5U/ul)10×缓冲液(Mg2+)3ul去离子水25ul总反应体系30ul栗鼠钉辫仗羽助饭恋冠轰锦庚诌竭禁贱哮蹿幻拥蠕匹淄货扰旅毅畦拾材篮实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化94℃变性5min后,开始以下循环: 94℃变性反应40s 55℃退火反应30s 72℃延伸反应1min 最后72℃反应2min32个循环PCR反应条件跌拧逗俄镇踏篡桨疤渴柄铭畅韭宅佳侠芹狞舰挽仑深蛆佬囤作副磷鸳屿屿实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR产物电泳检测PCR产物分析 取5ulPCR产物,采用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。(Promega公司),再加入30~300μlPCR反应物;进入C步骤。回收PCR产物常采用两种方法,即直接回收和从凝胶中回收,目前有许多公司出售相关的试剂盒。DNA回收纯化硅硷玉肃姆邱隔怒踢势宿诚挟伪毒钒弟垦黍扇遵折引熟矣玉柏敦隧扮承糯实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化