文档介绍：--------------------------校验:_____________-----------------------日期:_____________肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求:正文请统一用:;数字、英文用TimesNewRoman;标题用:四号,黑体,加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。实验目的1、掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽***比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。实验原理1、肝糖原的提取与鉴定糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三***醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。  CuSO4十2NaOH = Na2SO4+Cu(OH)2↓  2Cu(OH)2十C6H12O6 = 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O  2CuOH = Cu2O↓(红色)+H2O  Cu(OH)2= CuO↓(黑色)+H2O2、肝糖原定量测定糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟***呋喃甲醛,此化合物再与蒽***脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先臵于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。三、材料与方法:以流程图示意1、材料:(1)样品:鸡肝(2)试剂:95%乙醇、5%(W/V)三***乙酸(3)仪器和器材:普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管(2ml、5ml)、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板2、方法:(1)肝糖原的提取与鉴定混匀糖原水解液呈色对比+50%NaOH5滴+浓HCL5滴沸水浴15min,冷却加碘试剂2滴加碘试剂2滴糖原溶液2滴沸水浴2min,溶解沉淀沉淀(弃去)鸡肝约1g,剪碎+l3COOH1ml研磨至乳状+l3COOH3ml研磨成肝匀浆全部转入离心管中,离心3min(4000r/min)上清液(取2ml)离心5min(4000r/min)+2ml95%乙醇,混匀,静置10min沉淀上清液(弃去)白瓷板孔穴中糖原溶液1ml糖原水解液2滴+班氏试剂4滴沸水浴2min,观察变化(2)肝糖原定量测定在分光光度计620mm波长处,用空白管溶液调零,测定并记录各管溶液的吸光度(A)沸水浴10min,冷却加水至标线,仔细混匀,获得糖原提取液冷却,全部转入100ml容量瓶中沸水浴15min取3支试管,分别标记为空白管、标准管、样品管四、结果与讨论:①结果:实验数据、现象、图谱;②讨论:以结果为基础的逻辑推论,并得出结论。1、结果:(1)实验现象:1)肝糖原的提取与鉴定第一次离心后,肝匀浆分为2层,上层为上清液,不完全澄清,下层为淡褐色沉淀。图1肝匀浆图2肝匀浆第一次离心后加入乙醇混匀并静置后,溶液分层,上层为上清液,下层有白色絮状沉淀。第二次离心后,溶液分为2层,上层为上清液,试管底部有少量白色沉淀。图3第二次离心后的白色沉淀④加入蒸馏水并沸水浴后,白色沉淀溶解。⑤白瓷板上,糖原溶液加碘试剂后呈红棕色,与碘自身的黄色有明显区别。碘试剂2滴糖原溶液2滴碘试剂2滴图4呈色对比结果(左为糖原溶液加碘试剂,右为碘试剂)⑥往糖原水解液中加入班氏试剂后,溶液呈蓝色(班氏试剂本身为蓝色)。沸水浴后,溶液变为砖红色(生成砖红色沉淀)。砖红色沉淀图5糖原水解液图6沸水浴前图7沸水浴后2)肝糖原定量测定往鸡肝中加入KOH并沸水浴后,溶液变为红棕色。图8沸水浴后,溶液变为红棕色水浴前,空白管呈黄色,标准管呈绿色,样品管呈黄色(颜色比空白管浅)。水浴后,空白管无明显变