文档介绍：--------------------------校验:_____________-----------------------日期:_____________血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别:生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验日期实验地点合作者指导老师评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求:正文请统一用:;数字、英文用TimesNewRoman;标题用:四号,黑体,加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。3、了解柱层析技术。实验原理1、粗提(盐析法):蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素:表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时,蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子,从而夺取蛋白质分子上的水化膜,还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀,从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同,因此,利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析,便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来,达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。2、脱盐(凝胶层析法)  凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时,溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱。而盐的分子量较小,可通过网孔进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。3、纯化(离子交换层析法)   离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂;带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂,溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合,带正电荷的离子则不能,这样便可达到分离纯化的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同,因此,在同一醋酸铵缓冲液中,各蛋白质所带的电荷不同,可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。 4、纯度鉴定(电泳) 采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定,以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。三、材料与方法:以流程图示意材料:样品:健康人血清(新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生)试剂:的醋酸铵缓冲液、的醋酸铵缓冲液、的醋酸铵缓冲液、的4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、磺基水杨酸、2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。仪器及器材:层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪。粗提脱盐纯化纯度鉴定(盐析法)(凝胶层析法)(离子交换层析法)(电泳)方法:离子交换柱层析纯化磺基水杨酸检测蛋白质此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性取血清,边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液,混匀室温放置10min,4000r/min离心10min上清液(含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)过葡聚糖凝胶G-25层析柱×7cm)过葡聚糖凝胶G-25层析柱×7cm)4Ac4Ac缓冲液(2ml)洗脱,流出液量约1ml时开始检测蛋白质4Ac4Ac缓冲液(2ml)洗脱,流出液量约1ml时开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性盐析凝胶柱层系除盐4Ac缓冲液洗涤收集含有蛋白质的峰液12dBaCl2检测SO42-阴性4Ac缓冲液再生平衡4Ac缓冲液洗涤4Ac缓冲液再生平衡BaCl2检测SO42-阴性收集含有蛋白质的峰液12d离子交换柱层纯化漂洗电泳准备将氨基黑染色液倒入培养皿中,用镊子取出薄膜浸入染液中,染色5min。缓冲液(3ml)洗脱,流出液量约1ml开始检测蛋白质DEAE-纤维素柱不用再生,可直接用于纯化清蛋白取浓度最高的1管作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)除盐后收集的清蛋白lα球蛋白和β球蛋白2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)4Ac4Ac缓冲液流洗再生平衡电泳纯度鉴定从染色液中取出以染好的薄膜放入漂洗液中反复漂洗3~4次,直至背景无色为止。离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定用盖玻片一端沾取2~3μl待测新鲜样品,然后将沾有样品截面与纤维素薄膜点样线处轻轻接触,待血清完全渗入薄膜后移开。将薄膜架在电泳槽上,点样面朝下,点样端置阴极,盖上电泳槽盖