文档介绍：--------------------------校验:_____________-----------------------日期:_____________质粒DNA的提取、纯化与鉴定质粒DNA的提取、纯化与鉴定摘要:本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5)中提取pUC19质粒,旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析,探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。关键词:碱变法质粒电泳实验目的:学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。实验原理:质粒DNA的提取——碱变性提取法:提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中,碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单,易于操作,一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法,主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒,具有纯度高、步骤少、方法稳定,且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点,但提取成本高,需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等,沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA,但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。凝胶电泳进行DNA分离纯化:电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质,它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段,是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速,分辨率高,分辨范围广。此外,凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)或SYBRGold染色直接观察到,甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话,这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收,用于各种各样目的的实验。4-105。琼脂糖加热至90℃左右,即可溶化形成清亮、透明的液体,浇在模版上冷却后形成凝胶,其凝固点为40-45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低,但它的分离范围更大(50至百万bp),小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作,适用于核酸电泳,测定DNA的相对分子质量,分离经限制酶水解的DNA片段,进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中,由于核酸有磷酸基而带有负电荷,在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素:样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。主要仪器和材料试剂:仪器和材料:菌体:,具有Ampr标记的质粒pUC19。实验试剂:LB培养基,抗生素(氨苄青霉素),溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,RNaseA母液,TE缓冲液,饱和酚,氯仿/异戊醇混合液,酚/氯仿/异戊醇(PCI)混合液,预冷无水乙醇,TAE电泳缓冲液(10×),上样缓冲液(6×),琼脂糖,溴化乙锭(EB),DNA相对分子质量标准物DNAMarkerλ/HindⅢ实验方法菌体培养1配制40mL液体LB培养基(加入5%葡萄糖)、100mL固体LB培养基、并准备足量的移液管、200μl微量移液器头、1000μl微量移液器头、。(1)注意无菌操作(2)挑了单菌落的接种环要在三角瓶的液避接面处研辗,瞬间可看到菌体进入培养液造成的局部浑浊。2向液体LB培养基移取32μl氨苄青霉素,混合均匀。3将提前活化的DH5α受体菌,接种于液体LB培养基中。将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中,37℃,160r/min培养过夜至对数生长晚期。质粒DNA的提取1称量50mL离心管重量W1,取30mL菌液于已称重的50mL离心管中,配平后7000r/min离心5min。2弃上清,向离心管中加入5mL溶液Ⅰ,涡旋振荡,7000r/min离心5min。注意溶液Ⅰ要悬滴5次。3弃上清并称重W2,