文档介绍：影响PCR扩增因素的分析[摘要]:PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。DNA合成酵素最早于1955年发现(DNApolymeraseI),,但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素,因此不符合一连串的高温连锁反应所需。随着经济的全球化,PCR技术的广泛应用,研究PCR技术的影响因素闲的愈来愈重要。[关键词]:,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍[1]。聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR),又称无细胞克隆技术(FreeBacteriaCloningTechnique),是一种根椐生物体内DNA复制的某些特点而设计的,在体外对特定DNA序列进行快速扩增的技术。,主要是以高度保守的特定基因序列的基础上建立起来的,如核糖体RNA(rDNA)、gyrB基因、toxR基因等。自6O年代末,Woese首次运用rDNA分析生物的系统发育以来,rDNA数据库快速扩大,已成为细菌多样性、系统进化与发育研究广泛采用的序列。细菌的16SrDNA基因核苷酸序列具有高度保守性,它的序列变化与进化距离相适应,被称为一种进化分子钟。由于其进化速度大约是每五千万年发生1%的碱基变化,所以适用于种以上水平的鉴定。研究细菌16SrDNA最直接的方式就是通过基因测序并与Genbank、EMBL、DDB等国际通用的数据库比对,根据同源性的大小确定细菌种的归类。23SrDNA基因也是非常保守的序列,由于它与16SrDNA基因是线性串联排列,在此基础上就发展出利用16S-23SrDNA基因间区序列来对细菌进行鉴定的方法。这个基因区段的进化速度高于16SrDNA,因此可以发展成为细菌种甚至株的鉴定方法。除此以外,还有其它一些高度保守的序列,如gyrB基因(细菌中广泛存在的一种编码DNA的拓扑异构酶Ⅱ的B亚基的单拷贝基因)、toxR基因(弧菌中的***表达调控蛋白基因)等也越来越广泛的被用于对病原性细菌进行分子生物学鉴定。,