文档介绍：中国人民解放军军医进修学院;中国人民解放军总医院博士学位论文雄激素受体基因CAG重复序列多态性及雄激素与动脉粥样硬化关系的初步研究姓名:阴大伟申请学位级别:博士专业:老年医学(心血管病)指导教师:李小鹰;叶玲20080521军医进修学院博士学位论文雄激素受体基因GAG重复序列多态性及雄激素与动脉粥样硬化关系的初步研究中文摘要背景男性冠心病的发病率和病死率均明显高于同龄绝经前女性。近年来有关雄激素在男性动脉粥样硬化性疾病包括冠心病发病中的作用逐渐受到关注。有研究显示,男性冠心病患者血循环睾***水平明显降低;长期口服高剂量睾***制剂或经皮补充低刺量睾***可改善男性心绞痛症状积分和心肌缺血的客观指标;在男性冠心病患者冠脉内注入生理浓度睾***可增加冠脉直径和冠脉内血流;动脉粥样硬化好发于老年男性,而老年男性睾***水平明显降低,提示睾***与动脉粥样硬化之间存在关联。汇总,临床流行病学研究的结果,没有研究支持睾***与冠心病的正相关。血管内皮细胞的OX-LDL氧化损伤是动脉粥样硬化的发生过程中重要的始动环节。已经发现在心房、心室肌纤维、动脉内皮细胞及血管平滑肌细胞均有雄激素受体0埘表达。雄激素只在AR存在的靶组织中才能行使其生物学功能,雄激素作用的强弱与细胞内AR舍量密切相关。研究显示,AR的表达和功能受AR基因外显予1区(CAG)。多态性的调控。因此要研究雄激素对动脉粥样硬化的影响,AR是关键环节,而AR基因(CAG)。多态性与雄激素和冠心病的关系并不明确。本研究旨在通过对雄激素一雄激素受体一动脉粥样硬化三者之间关系的研究,以及雄激素受体基因CAG多态性对AR表达影响的研究,从基因和细胞水平探讨AR在动脉粥样硬化中发挥的作用。目的(1)研究AR基因(CAG)。多态性对ARmRNA和AR蛋白表达的影响;(2)研究不同浓度的睾***预处理对ECV304氧化损伤后NO、PAl一1、ICAM-1、PDGF—B和TGF-fll的变化,探讨睾***在动脉粥样硬化中可能的作用机制。(3)研究含不同CAG重复数AR基因的ECV304氧化损伤后,睾***干预治疗作用的差别。.(1)以pwtAR质粒和已鉴定CAG重复数的白细胞基因组DNA为基础,通过重组PCR、酶切、连接等方法构建含CAG重复数为0,8,21,34的AR表达质粒;(2)将含CAG重复数0,8,21,34的AR表达质粒转染HEK293细胞,TRIZOL提取总RNA,用于RT-PCR检测ARmRNA;细胞裂解液提取总蛋白,用于WesternBlot检测AR蛋白。分析并比较不同的CAG重复对AR转录及翻译的影响;(3)MTT法检测不同浓度睾***干预对ECV304细胞增殖的影响,连续观察96h;(4)RT-PCR比较不同浓度睾***干预后ECV304细胞ARmRNA水平的差别;(5)ECV304细胞分组,分别加入OX—LDL、不同浓度睾***预处理+ox—LDL和***他***(Flu,AR拮抗剂)预她g+OX—LDL,孵育30h后,收集培养液上清,***还原酶法检测NO,ELISA法检测PAI一1;收集细胞加裂解液提取蛋白,WesternBlot检测ICAM一1、PDGF—B和TGF-fll;(6)将含CAG重复数0,8,21,34的AR表达质粒转染ECV304细胞,之后用OX—LDL氧化损伤12h,加不同浓度的睾***干预24h,按照步骤(5)中的方法检测相应指标。结果(1)成功构建了含CAG重复数为0,8,21,34的AR表达质粒,经酶切、测序和序列比对,证实插入片段的大小、方向、阅读框和CAG重复长度正确;(2)CAG重复数与ARmRNA和蛋白水平之间的关系:对ARmRNA,CAGo最低,CAG34居中,CAG8和CAG:l最高;对AR蛋白,CAG8最低,,CAG。和CAG21最高。二者的变化并不一致;(3)低生理及生理浓度(3-30ni)的睾***对内皮细胞的生长无不良影响;而超生理浓度睾(3aM-30#i)36h后,高生理浓度睾m(300dv048h后内皮生长速度减慢。随着睾***作用时间的延长差别越发明显,生长曲线增长幅度明显变缓;(4)ECV304细胞ARmRNA转录水平随睾***浓度的增加而增加,在低~高生军医进修学院博士学位论文理浓度范围(3nM-300nM)内基本一致,在超生理浓度(3~30/心,0表达量进一步增加;(5)不同浓度睾***预处理对OX-LDL氧化损伤ECV304细胞后各指标检测的结果:OX—LDL引起NO、TGF-fl'I表达降低,PAI-1、ICAM一1和PDFGF—B表达增加;与OX—LDL组相比,,PDGF—B进一步降低,而在NO和TGF-/5'I的影响上前者继续下降,后者有增加作用;T300nM-30/