文档介绍：石蜡切片免疫组化染色步骤1、载玻片的处理:抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。为保证试验的正常进行,APES、Poly-L-Lysine等几种试剂,对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下::现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例***稀释的APES中,停留20~30秒钟,取出稍停片刻,再入纯***溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡5分钟,60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。2、常用酶消化::%~%,消化时间为37℃、10~40分钟,主要用于细胞内抗原的显示。:%,消化时间为37℃、30~180分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,如:Laminin(层粘蛋白),CollagenIV(IV型胶原)等。 (Saponin):一般使用浓度为2~10mg/ml的saponin溶液,消化时间为室温孵育30分钟。3、抗原热修复:  可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液,如TBS、PBS、重金属盐溶液等,但实验证明,()效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制,取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中,混匀,±,如因蒸馏水本身造成的pH值偏差,请自行调整。:切片脱蜡至水后,3%H2O2处理10分钟,蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器,室温冷却10~20分钟(注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗,下接免疫组化染色步骤。:切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后),计时1~2分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,PBS洗2分钟×3,下接免疫组化染色步骤。 :切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟,然后端离电炉,室温冷却20~30分钟,蒸馏水冲洗,PBS洗,下接免疫组化染色步骤。4、免疫组化染色步骤: (以美国ZYMED公司SP试剂盒为例) ①石蜡切片脱蜡至水。 ②3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。 ③蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行)。 ④5~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 ⑤PBS冲洗,5分钟×3次。 ⑥滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。 ⑦PBS冲洗,5分钟×3次。 ⑧滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。 ⑨PBS冲洗,5分钟×3次。 ⑩显色剂显色(DAB或AEC)。 自来水充分冲洗,复染,封片。①冰冻切片4~8mum,室温放置30分钟后,入4℃***固定10分钟,PBS洗,5分钟×3。②用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗,5分钟×2。下接免疫组化染色操作步骤。免疫组化常见问题的处理当免疫组化染色没有出现预期结果时,应系统地查找原因,而每一次只能排除一种可能的原因。对照/标本无染色  ①确认是否忽略了应该加的某种试剂,包括一抗、二抗、三抗及底物等。  ②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入,是否孵育了足够的时间。  ③对照抗体的标签确认