文档介绍：(透析和凝胶过滤)在蛋白质的研究中,经常要进行蛋白质脱盐,即将蛋白质同其它盐类小分子分离开。蛋白质脱盐的方法很多,各有优缺点。以下仅介绍常用的透析和凝胶过滤方法,可根据实验条件和要求选用。(一)蛋白质透析目的学****透析的基本原理和操作。原理蛋白质是大分子物质,不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质的过程中,常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。仪器、试剂、材料仪器烧杯;玻棒;离心机;离心管;冰箱;电炉。试剂1%***化钡溶液;硫酸铵粉末;1mol/LEDTA;2%NaHCO3。材料透析管(,长12-15cm)或玻璃纸;皮筋;鸡蛋清溶液:将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1:20混匀,然后用六层纱布过滤。操作方法透析管(前)处理:先将一适当大小和长度的透析管放在1mol/LEDTA溶液中,煮沸10分钟,再在2%NaHCO3溶液中煮沸10分钟,然后再在蒸馏水中煮沸10分钟即可。取5ml蛋白质溶液于离心管中,加4g硫酸铵粉末,搅拌使之溶解。然后在4℃下静置20分钟,出现絮状沉淀。离心:将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟。装透析管:离心后倒掉上清夜,加5ml蒸馏水溶解沉淀物,然后小心倒入透析管中,扎紧上口。将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中,进行透析,并不断搅拌。每隔适当时间(5-10分钟),用***化钡滴入烧杯的蒸馏水中,观察是否有沉淀现象。结果处理记录并解释实验现象。,才能使蛋白质沉淀下来。思考题在透析袋处理过程中,EDTA和NaHCO3起何作用?(二)凝胶过滤目的学****凝胶过滤的基本操作技术,了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。原理凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和聚丙烯酰***凝胶(Bio-gel-P)等。这些多聚高分子材料,通过适当浓度的交联剂作用即产生分子间横向的交联,形成具有一定孔径的网络结构。当用这类材料制成粒状凝胶颗粒后,颗粒内部就形成一种三维网状结构。这些凝胶材料是高度亲水的,在水溶液里吸水显著膨胀。实际工作中常用每克干胶吸水量(ml)的10倍(G值)表示凝胶的交联度,可根据被分离物质分子的大小和工作目的,选择适合的凝胶型号。当在柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时,自由通透的小分子可以进入胶粒内部,而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别较大,大分子只能沿着胶粒之间的间隙向下流动,所经路程短,最先流出。而渗入胶粒内部的小分子受迷宫效应影响,要经过层层扩散向下流动,所经路程长,最后流出。通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子分离。凝胶过滤的操作条件温和,适于分离不稳定的化合物;凝胶颗粒不带电荷,不与被分离物质发生反应,因而溶质回收率接近100%,而且设备简单、分离效果好、重现性好,凝胶柱可反复使用,所以广泛使用于蛋白质等大分子的分离纯化、分子量测定、浓缩、脱盐等用途。本实验利用凝胶过滤的特点,将(NH4)2SO4盐同蛋白质分子分离开。仪器、试剂、材料仪器层析柱(ф2cm×15cm);真空泵;真空干燥器;恒流泵;核酸蛋白检测仪;部分收集器;记录仪。试剂1%***化钡溶液;硫酸铵粉末;SephadexG-25。材料鸡蛋