文档介绍：一般的sp法步骤啊,具体如下:1、烤片,68℃,20分钟,:依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯,,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-:脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2-甲醇溶液浸泡10min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。:冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍(900μlPBS:100μl血清封闭液)。:将温箱中的载玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,不洗,加一抗,如果做对照实验,就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜(≥18h)。:将载玻片从冰箱中取出,4℃过夜后在37℃复温45分钟,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。:将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上SABC,然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍(990μlPBS:10μlSABC)。:将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀)A:DABB:H2O2C::将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。然后盐酸酒精分化。:将复染后的片子置于水中冲洗后,依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。:用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片,甲醛固定有时比冰冻***好;但对于不同的组织和抗原,可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液,请于购置前注意说明书。(1)BouinS固定液:饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织的穿透力较强,固定较好,结构完整,但因偏酸,对抗原有一定损害,且组织收缩明显,不适于组织标本的长期保存。(2)PLP液:即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛,适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。、透明时间不能太长,否则在切片时容易碎片,切不完整。,这时可适当地在水中加入几滴乙醇。℃30分钟或37℃过夜,温度太高或时间太长,抗原容易丢失。℃-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂,6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液,适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行,可用双重处理(APES和Poly-L-Lysine)的切片。在以上两种条件都行不通的情况下,可用如下方法:切片在脱蜡前,放在APES1:50***溶液中浸泡3分钟,晾干,即可进行下一步。(1)HRP系统:3%双氧水灭活(2)AP系统:3%HAc灭活。,必须采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。,非特异性染色仍然较强时,“现用现配”的原则,对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。、反应时间、反应温度等合适的条件下,如果背景依旧高,可采用含1‰Tween20的PBS洗,特别是在显色之前要多洗。,可用碱性缓冲液(如PBS)或Na2