文档介绍：聚合酶链反应对酶联免疫吸附试验HBsAg阴性样本中病毒核酸的检测    乙型肝炎是HBV感染引起的全球性疾病,而我国是乙型肝炎的高度流行区。据调查统计,在我国人群(3岁)%,HBV流行率高达60%以上[1]。发病例数约为50万[2],乙型肝炎     作者:房景霞刘宇思孙绍秋李玉梅房辉    作者单位:063000河北省唐山市中心血站(房景霞、孙绍秋、李玉梅);大连医科大学(刘宇思);河北省唐山市工人医院(房辉)  乙型肝炎是HBV感染引起的全球性疾病,而我国是乙型肝炎的高度流行区。据调查统计,在我国人群(>3岁)%,HBV流行率高达60%以上[1]。发病例数约为50万[2],乙型肝炎的主要传播途径是临床输血传播,我国各级采供血机构对乙型肝炎的筛查检测为酶联免疫检测,但由于酶联免疫吸附法(ELLSA)检测“窗口期”的问题,标本检测漏检在所难免。我站自2008年9月至2009年1月,对无偿献血者血液样本HBsAgELISA检测阴性的合格样本(共计26109份)行PCR检测,对PCR检测HBVDNA阳性的血液做报废处理,并对这种献血者跟踪验证,每两周采血做HBV两对半免疫检测。报告如下。 1 资料与方法  一般资料  选择我站无偿献血者HBsAgELISA检查合格血液标本(共计26109份),分离血浆备用。DP1000核酸提取仪(上海科华实验系统有限公司),ABI7300荧光PCR扩增仪(上海科华)。试剂乙型肝炎荧光PCR试剂盒(上海科华生物有限公司,批号:20080328)。  方法  核酸筛查的样本准备和汇集:采用Pooling8方式,,加入40μl浓缩剂,再加入50μl促沉剂,混匀后4℃离心1h(26000r/min),弃去离心管内上层液体,剩余约160μl标本,振荡混匀,低速离心数秒后用于核酸提取。  核酸提取:从每个离心管中吸取100μl待测汇集标本,加入去抑制剂磁珠混合溶液20μl,再加入130μl裂解液,采用核酸提取仪,根据仪器提示,依次加入洗涤液A、B、C及洗脱液,分离提取HBVDNA模板。  PCR扩增检测:在装有已配制好的PCR反应液的反应管中分别加入15μl已处理好的标本。然后将PCR反应管放入ABI7300荧光PCR扩增仪进行扩增检测。PCR反应程序:通过预变性:95℃,2min;变性:95℃,10s;退火:55℃,20s;延伸:72℃,20s循环检测。  结果判定  测定CT值≥50,并且内标CT<45的标本为阴性标本,测定CT值在40~50的标本为灰区标本,建议复测或随访,测定CT值<40的标本为HBVDNA阳性标本,须进行拆分。  阳性混合样本的拆分  混合样本阳性者均应进行拆分,找到各个样本并分别进行单独的核酸检测,以确定阳性样本的真正来源。并对HBVDNA阳性献血者血液做报废处理。  随访  所有HBsAg阴性,HBVDNA阳性的样本都进行随访,并做HBV两对半免疫检测,再次采血应用不同于二次筛查的试剂进行HBsAgELISA检测,以便查找ELISA检测与核酸检测结果不一致的原因。 2 结果  PCR筛查结果  26109份HBsAg阴性