文档介绍：【doc】p16基因***化的芯片定量检测p16基因***,451[研究简报]p16基因***化的芯片定量检测沈佳尧?,侯鹏,祭美菊.,李松,何农跃.(,苏州215007;,吴健雄实验室,南京210096)关键词DNA***化;荧光强度标准曲线;p16基因***化检测型基因芯片中图分类号0657文献标识码A文章编号0251—0790(2005)03—0449—03pl6基因的失活与多种肿瘤相关,但pl6基因缺失率较低,突变更为罕见,pl6基因启动子区CpG岛***化与其蛋白表达密切相关[***化已成为目前研究的热点,现有的技术包括:Southernblot法引,限制性内切酶一PCR法,DNA测序法[引,***化特异性PCR(MSP)[引,单链核苷酸引物延伸法[,变性高压液相色谱法和微阵列技术等[.但用这些方法无法定量检测具体位点的***,定量地检测DNA***化,我们利用微阵列技术建立了定量检测p16基因启动子区CpG岛***化的方法,对胃癌组织样本作了定量分析,并进行了***,寡核苷酸探针由南京百龙公司合成;y一氨基丙基三乙氧硅烷(APTES),亚硫酸氢钠,对苯二酚和硼氢化钠购自Sigma公司;pMD18一TVec—;CarticianTech5415D离心机;EppendoffScanArrayLiteMicroarrayAnalysisSystem基因芯片荧光扫描仪;PackardBioehipTechnologiesMODEL2000杂交箱;***化的新鲜胃癌组织D..,用酚一***仿法抽提DNA,:5’-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA..3,MR:5,-TAC—TGCAAACT..:反应体系30L,其中含10倍PCR缓冲液3L,Mg+,dNTPs200/~mol/L,引物各1/~mol/L,模板DNA1L,:于95?预变性5min,95?变性60S,62?退火60S,72?延伸30S,共3o个循环,最后在72?***化,则包含2个TaqI酶切位点(TC{,GA).***化纯阳性和纯阴性克隆的获得将MF和MR的PCR扩增产物割胶回收,与pMD18一TVector连接,,***化特异性引物MS,M1A和M2A构成半巢式MSP[u]及TaqI酶切对阳性重组克隆进行***化纯阳性和***化纯阴性克隆的筛选,***化检测型芯片的制备基因芯片的制备包括玻片的清洗及硅烷化,手臂分子的联接和探针的点样及固定等三个步骤,经化学处理后醛基化的玻片与一端