文档介绍：实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的:1、学****并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。2、初步了解DNA纯化的原理。二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如,***化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、***仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DN***段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在分子生物学实验室中常用。三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内()2、将试管放入恒温震荡培养箱中,37℃,200r/min培养12-16h。3、(尽量倒满)1200r/min,离心30s(沉淀菌体)4、重复一次第三步的过程5、弃掉上清液并扣干,加入预冷的Solution1100微升,剧烈震荡打散菌体6、加入新配置的Solution2200微升,温和颠倒试管6-7次混匀,室温放置5min,使液体由浑浊变为透明粘稠7、加入预冷的Solution3150微升,温和颠倒离心管2-3次,震荡7-8次,之后在1200r/min离心7min8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管中(400-500微升)9、加等体积的***仿,轻微震荡,1200r/min,离心2min,之后将上清液转移至另一离心管10、加入2倍体积冰冷无水乙醇,轻轻颠倒离心管混匀,室温放置2min,1200r/min下离心10min11、弃上清,加入70%乙醇洗涤沉淀,12000r/min,离心2min,弃上清12、弃上清,液体尽量倒净,并在吸水纸上扣干,室温静置15min干燥13、加入1*TE40微升溶解质粒,用于定量分析、电泳检测等实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、学****DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。二、实验原理1、关于电泳技术:电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此,电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一,其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖是一种海藻多糖,琼脂糖胶分离范围很大,但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离200到50,000