文档介绍：实验三:免疫印迹1原理免疫印迹又称Western印迹(Westernblotting),与DNA的Southern印迹技术相对应,两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜),然后用探针检测特异性组分。不同的是,Westernblotting所检测的是抗原类蛋白质成分,所用的探针是抗体,它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点,具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测,以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前,Westernblotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。免疫印迹可分成两个步骤:蛋白质由凝胶转移至固相基质;特异性抗体检测。蛋白质转移通常由电泳实现,现常用的方法有二:1半干法:将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间,通电10-30分钟可完成转移;2湿法:将凝胶和固相基质夹在滤纸中间,浸在转移装置的缓冲液中,通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有***纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用***纤维素膜进行转移。转移结束后,蛋白质的检测可分成三个步骤进行:首先,将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜,然后将膜同可特异性识别上述抗体(一抗)的第二抗体(二抗)孵育,通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。本实验用的是酶标抗IgG,故不加一抗。(所有试剂均供两组用) 转移缓冲液Tris   20mL加蒸馏水约800mL,, Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris  ,, TTBSTBS 800mL Tween-20   封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉   底物溶液二氨基联苯***(DAB)   18mLH2O2    20μl    丽春红总蛋白质染色液丽春红 1g4%乙酸  5%小牛血清生理盐水小牛血清  %(1:1500)酶标抗IgG  % 夹心式电泳槽,电泳仪,***纤维素膜,直径9cm培养皿,剪刀,镊子,刀片,微量移液枪, SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同,故此处从略。不同之处如下: 样品制备:,,振摇后10000rp/5min离心,取80μl上清液加入等体积的样品缓冲液,在沸水浴中加热3min。瞬间离心,取上清液上样。 加样:拔出梳子,用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。上样量从左到右为5、20、15、10、5、5、5、5、10、15、20、5μl(从中间分开,两侧对称)。 电泳:稳流10mA电泳,