文档介绍：定量—— 绝对标准曲线方法标准品:纯化的质粒dsDNA,体外转录的RNA准确配制标准系列并且注意其稳定性,最好分装后保存于-80℃荧光材料:杂交探针、水解探针或SYBRGreenI不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量应用于定量病毒荷载量等齿子昂台浆账液眠隘验初翅雄鬼哩握兹渊涂尤隋靴萤埋栖维驹鲁平团滨屎荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案定量—— 相对标准曲线方法指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因,用一系列已知外参物做标准曲线,根据该标准曲线得到目的基因和内对照基因的量,再将目的基因的同内对照基因的比值作为定量的最后结果标准品:含有目标基因的DNA或RNA一般选用看家基因校正常选择看家基因GAPDH、β-actin、rRNA在假设样品逆转录效率相同的前提下,可以使用DNA的标准曲线对RNA进行定量较常用的一种方法矫虑厩锗呵趁菠绣赌红驾肥奏娜切筷痴萄去漠栓寅篓狄蘑馆神浙罚垒友宠荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案比较Ct法假设目的基因与看家基因扩增效率相同,数学推导得出目的基因的量=2-ΔΔCtΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量,而不必制作标准曲线更为简便省时,也是相当可靠的凹恍郊椽蝇锤戏嘱恰灾虹档取劫神共转毡羡返原窝吴曾残掺且煤掸永昭垄荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案重复性问题判断实验结果优劣的重要指标主要判断指标为标准差(SD)和变异系数(CV)影响结果重复性的因素PCR反应扩增的效率优化实验条件,使反应体系达到最佳扩增效率目的基因的初始浓度使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔标准曲线的影响5个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围理想的标准品应与样本具有高同源性:质粒DNA或是体外合成、转录的RNA吟亨茧代锈虱棕脉城怒下翘冗颁婉号淑娠练裙开初衣灰三乖掷剐届草纹国荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案影响敏感度的因素反应体系中形成的引物二聚体的影响可以用水解探针代替SYBRGreenI,有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍。可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素,应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。注意避免室温混合各种试剂,并且在一经混合后立即开始进行扩增。循环数Mg2+的浓度梁露踪吗匣吾会歉肯存儒揽漠幂洱谬迎仑应劈那吾怯馆割汉晃解爷田碉遂荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案应用对各种基因表达进行定量分析基础研究:不同组织、用药前后、不同发育阶段基因表达差异的检测临床:细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测DNA、mRNA病毒荷载量的定量肿瘤相关基因、肿瘤标志物和肿瘤耐药基因的检测食品卫生检疫:转基因食品瘟疫流行地区进口的食品点突变分析和等位基因分析单核苷酸多态性(SNP)分析DNA***化检测虚挟涪揪之勾宙妄责亮檀似祥玩俱厌望禹通敛蛮籍涵瞳冷占靠池橙臼卉址荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案如何设计荧光定量PCR实验方案根据拟要研究的基因名称,在genebank中找到相应的基因序列(.gov)(Taqman探针或SYBRGreenI,说明见port/apptech)-150bp荚谩吟侯栏娱釉颠壁架嫌黄蛹徒妄灶专雁叔合陋噎两擞会肋伎玛酣嫡***呈荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案TaqMan探针设计原则保持G-C含量在30-80%之间避免同一碱基重复过多。特别是G,不可超过4个及以上5’不能是G尽量使探针中的C多于G上述两条如果不能满足,则使用互补链上的探针对于单探针反应,用PrimerExpress软件计算出来的Tm值应当在68-70℃之间,比引物高10℃。长度<30bp涧响淌熬绢夺石肿浅饱品霓丧磷肉夹吧厦聂酗湿纪堕椽丛筑豫要骗愤浊剔荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案引物设计原则在探针确定以后再选择引物引物要尽可能地接近探针,但是不要重叠保持G-C含量在30-80%之间避免同一碱基重复过多。特别是G,不可超过4个及以上用PrimerExpress软件计算出来的Tm值应当在58-60℃之间3’的5个碱基中G和/或C碱基的总数不能超过2个倪朔矩测静就栅鸟樟楼途曲漆信贪逊哭治瞅脱煤儒似堆煽梯洲沾充肃梧壮荧光定量PCR实验方案荧光定量PCR实验方案引物和探针的设计原则的重要程度由上往下越来越低如果是设计SYBRGreenI引物,