文档介绍：2010级研究生《植物科学实验技术》双向电泳技术(524lab)一、实验目的:了解蛋白质组学研究中的基本实验设计思路,掌握蛋白质组双向电泳实验流程及相关软件分析。二、材料与试剂材料:①叶片(墨兰、石斛)②花芽(春石斛、蝴蝶兰)③蝴蝶兰花瓣(白色、红色)④蝴蝶兰花苞仪器:聚焦仪,天平,电子秤,适用于2ml、10ml、50ml离心管的高速离心机,PH计,磁力搅拌器,低温冰箱,真空泵,紫外分光光度计,水浴锅等试剂:三***乙酸(TCA),***,β-巯基乙醇,Tris-base,牛血清蛋白,考马斯亮蓝G-250,无水乙醇,尿素(Urea),硫脲(Thiourea),CHAPS,DTT,碘乙酰***IAA,IPGbuffer,PH3-10,IPG预制胶条(7cm,PH3-10),丙烯酰***,甲叉双丙烯酰***,SDS,过硫酸铵(Ap),甘氨酸Gly,硫酸铵,甲醇,溴酚蓝,超纯水,液氮,正磷酸等器皿:研钵,10ml、50ml、100ml、500ml容量瓶,10ml、500ml烧杯,、50ml离心管,50ml量筒,1ml、5ml、、10ul、20ul、100ul微量移液器,100ml棕色瓶,冰盒,滤纸,玻璃棒,记号笔,布氏漏斗,试管等三、实验流程I样品制备A:蛋白质制备方法(全程低温,操作尽量快、准;双向电泳最重要、最基础步骤)A-1TCA/***沉淀法——墨兰、,在预冷的研钵中,,加入6-8ml10%TCA/***,-20℃沉淀过夜(至少2小时),,离心(13200rpm、4℃、30min),-8ml冷***,混匀并进行重量平衡,-20℃沉淀20min,离心(13200rpm、4℃、30min)弃上清。(此过程重复三次)-8ml80%冷***混匀并进行天平平衡,-20℃沉淀20min,然后离心(13200rpm、4℃、30min),弃上清。(此过程重复两次),加1ml冷***洗涤、沉淀两次(),干燥沉淀至干粉,-80℃低温保存。(补充:醋酸铵/甲醇沉淀法:基本步骤同TCA/***沉淀法,)A-2酚抽提法——石斛、,在预冷的研钵中,,加入酚抽提液与水饱和酚混匀,离心(13200rpm、4℃、20min),(①液),剩余下层水相,加入Tris饱和酚混匀,离心(13200rpm、15℃、20min),(②液),下层水相及杂质丢弃,①和②-20℃沉淀过夜(4h以上),离心(13200rpm、4℃、30min),倒掉上清,加入6-8ml冷***混匀,-20℃沉淀30min,离心(13200rpm、4℃、20min),弃上清。-8ml80%冷***混匀,-20℃沉淀20min,然后离心(13200rpm、4℃、30min),弃上清。,加1ml冷***洗涤、离心沉淀两次(),干燥沉淀至