文档介绍：山东农业大学博士学位论文中文摘要RNA沉默是生物(特别是真核生物)细胞抵御外来核酸(病毒、转座子或转基因)入侵以保持生物自身基因组完整性的一种防御机制。dsRNA为诱发RNA沉默的关键因子。利用DNA重组技术,构建病毒基因发夹结构的RNA(hairpinRNA)(转录后均形成dsRNA)的植物表达载体,转化植物,获取抗病毒转基因植物是利用基因工程技术控制植物病毒病害的最有效策略,这一策略通常称为RNA介导的病毒抗性()。RNA介导的病毒抗性具有抗性强、抗性持久、生物安全性高等特点。尽管如此,但由于公众出于对转基因植物的生态风险和食品安全性的考虑,抗病毒转基因植物的应用仍然受到极大地限制。新近的研究表明,通过细菌原核表达dsRNA同样能够干扰植物病毒的侵染。与获得抗病毒转基因植物相比,利用细菌表达病原dsRNA沉默病毒基因的表达具有更高的生物安全,更易被接受。烟草病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍、危害严重的一大类病害。其中分布广、危害严重的有马铃薯Y病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)等。在田间,病毒病多混合发生,给烟草生产带来巨大损失。病害流行的年份,由病毒病造成的烟叶产量损失可达30%"-'50%,个别地块甚至绝产。本研究以PVY和TMV的部分功能基因的热点位置为靶序列构建hpRNA载体,利用原核表达dsRNA的策略,比较PVY不同功能基因及同一功能基因的不同区段的抗病效果,并探讨利用该策略同时抗两种病毒的基因投递方式对抗病效果的影响进行,为利用该策略抗植物病毒的研究提供了理论依据。主要研究结果和结论如下:(1)原核表达马铃薯Y病毒基因组不同功能基因的双链RNA抗病毒研究利用PCR技术扩增PVY外壳蛋白基因(CoatProtein,CP)、复制酶基因(NuclearInclusionProteinb,NIb)和辅助蛋白(ponemProtein,)基因中间区域长度为600bp的cDNA片段,构建发夹RNA(hpRNA)结构的原核表达载体,,经IPTG诱导,均可表达600bp的dsRNA,证明所构建的dsRNA表达载体正确。用原核表达PVY外壳蛋白基因、复制酶基因和辅助蛋白基因的dsRNA处理烟草植株,进行抗病性鉴定。检测结果显示,原核表达PVY病毒不同功能基因的dsRNA均能保护植物抵抗PVY病毒的侵染,但介导的抗病性存在着差异。其中来源于复制酶基因的dsRNA介导的抗病效果最好,72%左右的处理植株表现为抗病;来源于衣壳蛋白基因的dsRNA介导的抗病效果较好,56%的处理植株表现为抗病;而来源于蚜传辅助蛋高沉默效率植物病毒双链RNA的抗病毒研究白基因的dsRNA介导的抗病效果较差,表现为抗病植株占处理植株的比例为46%。(2)原核表达马铃薯Y病毒N/b基因的不同区段的双链RNA抗病毒研究根据已克隆的马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的复制酶(N/b)基因序列设计引物,利用PCR扩增N/b基因的5’端、中间、3’端各500bpcDNA区段,,构建了3个hpRNA结构的原核表达载体pGEMNIb-1、pGEMNIb-。经IPTG诱导,,经DNase和RNaseA消化处理,证实为dsRNA。提取表达的PVYNIb基因不同区段的dsRNA处理烟草,进行抗病毒试验,结果显示,表达N/b基因不同区段的dsRNA均能保护植物抵抗病毒的侵染,但区段间存在显著差异,中间区段效果最好,抗性植株的比例为66%;3’端次之,抗性植株的比例为52%;5’端区段效果最差,抗性植株的比例仅为34%。Northernblot分析结果表明:目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的,21"--25nt的siRNAs是RNA沉默的效应分子。(3)原核表达PVY、TMV的dsRNA多抗病毒研究基于前期研究结果,选取了抗病效果较好的PVY的CP和砌,TMV的CP和MP基因热点位置序列,构建了包含PVY、TMV的单病毒cDNA区段及2种病毒嵌合基因cDNA区段的6个hpRNA载体,IPTG诱导目的dsRNA表达,比较单病毒dsRNA的混合物和病毒嵌合基因的dsRNA的抗病效果。结果显示:两种原核表达的dRNA投递策略均能够同时介导对PVY、TMV两种病毒的抗性,但单病毒dsRNA的混合物较两种病毒嵌合基因的dsRNA具有更好地保护效果,%。siRNANorthernblot结果表明,该抗性是由RNA介导的。关键词:马铃薯Y病毒;烟草花叶病毒;原核表达;双链RNA;热点位置序