文档介绍：酶联免疫吸附剂测定实验(ELISA)
姓名:夏晶学号:2009011642 班级:力9 同组人员:奚柏利
实验原理
ELISA是一种免疫测定(immunoassay,IA) 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,由此进行定性或定量分析。
此次实验采用间接法,是检测抗体最常用的方法。
这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。
二、实验试剂及器材
器材:聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔),酶联免疫检测仪
试剂:辣根过氧化物酶羊抗兔IgG
包被液( mol/L碳酸缓冲液(pH ),Na2CO3 ,NaHCO3 ,用蒸馏水稀释至100 毫升)
稀释液(PBS-Tween)(NaCl 8克, KCl ,KH2PO4 ,Na2HPO4·12H2O ,Tween-20,,用蒸馏水加至1000毫升)
洗涤液:同稀释液。
封闭液: % (质量分数)BSA(用PBS配制)。
邻苯二***溶液(底物)( mol/L 柠檬酸(),
mol/L Na2HPO4·12H2O(),,取邻苯二***8毫克(溶解),临用前加30 % (体积分数)H2O2 40 微升)
终止液:2 mol/L H2SO4。
实验步骤
包被抗原
用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10微克/孔,用微量加样器每孔加200微升(用定量多道加液器,使加液过程迅速完成), 37 ℃温育半小时。
2)洗涤:a倒尽孔中液体后每孔加200微升洗涤液,将洗涤液注满板孔.
b放置1-2分钟,间歇摇动,甩去液体后将反应板倒置在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽。
c反复三次。
3)每孔加封闭液200微升,37 ℃温育半小时。
4)洗涤同2。

1)用稀释液将被检血清作几种稀释(稀释倍数见下表格)。
2)对选定的36个孔分为12组,其中10组每孔按组别加入浓度不同的200微升;1组加稀释液,以为对照;1组不处理。
3)37 ℃温育一小时。
4)洗涤同2。
3. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG
1)每孔加入200微升, 37 ℃温育半小时。
2)洗涤同2。
4. 加底物邻苯二***
1)邻苯二***溶液(邻苯二***在临用前才加入,用前还要加30%H2O2)每孔加200微升。