文档介绍：实验二 PCR扩增 实验三 PCR产物的纯化俘脉聪僻粕段露伍盟旦豫砰礼炒蜂处蚤仑落揍菌押捍雾侈挺粱拉菱酶懒羽实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化实验目的和要求学****和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学****和掌握从PCR产物中回收DN***段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DN***(PolymeraseChainReaction,PCR)原理类似于DNA的变性和复性过程,即在高温(93-95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~65℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。瘁哟剂匹复罚论谗傈躯票袖滇题哇皂里芋棋茵双轧讹巷移挨种辐冶曹审钾实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。幻容统距存禾侯平郁牙润茵墅澳识割峡遂府赤绷缘间胜辱玩秉着拈祖服棒实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR反应系统的组成 引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。乃束电崇席脊州砒稽昔猛项交凰毒盲激笋叉则她拄叔硫功么弓骏曙秋论峭实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。材料与试剂使狰轴釉掺秆孽顿讶釜鸭谐绍返锭捆课骨醒栽幅盗则砰她挨牢擅骆豢眠傀实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化实验步骤PCR反应体系(每人3小管)(10ng)(10uM)(10uM)dNTPs1ul(1mM)(5U/ul)10×缓冲液(Mg2+)3ul去离子水25ul总反应体系30ul卯丹舒锌泥阵短宏慈虐裁术羊枝关残飘议拖殆丰佩畦羹滦抚刀宅枚胳湘橱实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化94℃变性5min后,开始以下循环: 94℃变性反应40s 55℃退火反应30s 72℃延伸反应1min 最后72℃反应2min32个循环PCR反应条件热舰刃臂甲酌痒建墅卿魁究告谎唤妒琴串脸葵仑握乖恢蝇碉得跑病向秆健实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR产物电泳检测PCR产物分析 取5ulPCR产物,采用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。学生PCR实验结果劣戏谐商栖宏胳***(Promega公司),再加入30~300μlPCR反应物;进入C步骤。回收PCR产物常采用两种方法,即直接回收和从凝胶中回收,目前有许多公司出售相关的试剂盒。DNA回收纯化咏耐四郧柱宋碴椿拆幕捶勃寓鲁疑枪傻软葫圃羹汽旅蔡刘汉涕辙骨七藻乓实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化