文档介绍：江苏大学硕士学位论丈摘要人源DNA聚合酶6(Pol6)是由p125、p50、p68和p12四个亚基组成的异源四聚体,在参与染色体DNA复制和各种形式的DNA损伤修复过程中都扮演着十分重要的角色。然而,不论是从培养的动物细胞或组织中分离提取的天然酶复合物,还是通过基因工程手段获得的重组酶蛋白复合物,其酶的纯度及产量均无法满足对其结构和功能深入研究的需要。本论文研究利用新型的MultiBac系统,将人源DNA聚合酶Pol6的一个或多个亚基装配到杆状病毒表达载体pFBDM中,构建出含Pol6异源四聚体或不同亚基组合的重组杆状病毒,并在Sf-9昆虫细胞中过量表达。为了高效大规模地分离纯化出高质量的Pol6各咂基不同组合的蛋白复合物,本研究通过制备抗催化大亚基p125的抗体,利用CarboLink聊CouplingGel制备抗p125的免疫亲和层析柱。利用所制备的免疫亲和层析柱,结合FPLCMonoQ柱,从500ml感染的Sf-9细胞中,获得了大约5mg的Pol6异源四聚体。在以Poly(dA)/oligo(dT),利用本分离纯化策略所获得的Pol6四亚基酶复合物具有与从真核细胞中分离提取的天然Pol6相同的酶活性。同时,Pol6的其它各亚基复合物:核二聚体p125/p50,三聚体p125/p50/p68(Pol63一p12)和p125/p50/p12(Pol63-p68),也以相同的方法被构建、在Sf-9细胞中过表达、分离纯化并进行酶活性的对比分析。通过所制备的免疫亲和柱及改进了的分离纯化策略,能够极大地提升大规模、高酶活的人源DNA聚合酶6分离纯化的效果。本研究为从癌症发病的源头上深入研究由于Pol6功能改变而引起遗传基因组人源DNA聚合酶6分离纯化方法的研究不稳定所致肿瘤或其它疾病发生的机制提供了一个重要平台。关键词:DNA聚合酶6;免疫亲和层析;MultiBac系统;异源四聚体;亚基复合物江苏大学硕士学立论丈ABSTRACTMammalianDNApolymerasedelta(Pol6)plexconsistingofthep125,p50,,esoneofthemajorbarriersforitsin·,plexanditssubassemblieswerereconstitutedbyconstructionofoneormultiplesubunitsintoasinglebaculoviruswithanovelMultiBacsystem,overexpressedininsectcells,,apolyclonalantibodyagainstp125catalyticsubunitWaspreparedandimmobilizedafterperiodateoxidationandcoupledtoahydrazide—-9cells,aheterotetramer,binanthumanPol6,-parisonofitsactivitiesbothonPoly(dA)/oligo(dT)template—,posedofp125andp50subunitsandthetrimerslackingp12orp68subunit,werealsoreconstituted,overexpressed,isolated,,ourimprovedprocedureprovidesasignificantadvanceintheisolationofPol6inallowingitsfacileisolationfromoverexpressedinsectcellsornaturalsourceingoodyieldand