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1实时定量荧光PCR技术服务.doc

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文档介绍:附录1:康成生物实时荧光定量PCR技术服务实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异、验证基因芯片和siRNA干扰的实验结果。康成生物为您提供的全套实时荧光定量PCR技术服务,全部实验皆使用进口试剂完成;定量PCR仪器为美国应用生物系统公司生产的荧光定量PCR仪ABIPRISM®7700或ABIPRISM®7900、CorbettResearch公司生产的离心式实时定量PCR仪Rotor-Gene3000。主要实验步骤如下:设计并合成RealtimePCR引物。2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR®Green)的PCR反应的优化。3.客户样品RNA抽提若实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA。若实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。4.RNA质量检测紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度。使用甲醛电泳试剂(ambion)进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。5.按照逆转录酶(Invitrogen或Promega)使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。6.制备标准曲线样品:进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。7.标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTimePCR反应

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上传人:q1188830 2019/12/11 文件大小:0 KB

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