文档介绍：货号:MS3602规格:100管/48样糖原磷酸化酶b(Glycogenphosphorylaseb,GPb)试剂盒说明书微量法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义:糖原磷酸化酶(Glycogenphosphorylase,GP,))是糖原分解代谢的关键酶,使糖原分子从非还原端逐个断开α-1,4-糖苷键移去葡萄糖基,释放1-磷酸葡萄糖,直至临近糖原分子α-1,6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶b(GPb)两种形式。GPb在一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)存在下可被激活。测定原理:GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP还原生成NADPH,在340nm下测定NADPH上升速率,即可反映GP活性。添加一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)时测定GP(GPa和GPb)活性,未添加腺苷酸(5,-AMP)时测定GPa活性,GP活性-GPa活性得到GPb活性。自备实验用品及仪器:紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制:提取液:100mL×1瓶,4℃保存;试剂一:液体16mL×1瓶,4℃保存;试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;试剂三:粉剂×1支,-20℃保存;试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;试剂五:粉剂×1支,-20℃保存;样本的前处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。测定步骤:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零;2、工作液的配制:临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。3、试剂三的配制:临用前在试剂三瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。4、试剂四的配制:临用前在试剂四瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。5、试剂五的配制:临用前在试剂五管中加入500μL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。第1页,共2页6、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于37℃预热5分钟;7、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四、10μL蒸馏水和160μL工作液,立即混匀,记录340nm处5min后的A1和10min后的吸光值A2,计算ΔAGPa=A2-A1。8、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三、10μL试剂四、10μL试剂五和160μL工作液,立即混匀,记录340nm处5min后的A3和10min后的吸光值A4,计算ΔAGP=A4-A3。注意:由于每个样本需要同时测一个GP(GPa和GPb)活性和一个GPa活性,因此本试剂盒100管测48个样本。GPb活性计算::(1)按样本蛋白浓度计算单位定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。GPb(nmol/min/mgprot)=[(