伊氏锥虫hgprt基因的rt—pcr扩增及克隆.doc

文档介绍：伊氏锥虫HGPRT基因的RT—PCR扩增及克隆伊氏锥虫HGPRT基因的RT—PCR扩增及克隆?—&7壬叠兰,,/王德昭,(..62)摘要:参照布氏锥虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)基因的桉苷酸序列,设计合成,1对引物,引物间距为630bp,,—TEasy载体,经筛选鉴定,,,提示有良好的抗原性关键词:笆匪壁皇;H—GP—RT;R—T-P—CR;扩增;克隆琉取性眉腥中图分类号:$:A文章编号:10054545(20O0)03—0254—03次黄嘌岭鸟嘌呤磷酸桉糖转移酶(HGPRT)是锥虫外源途径合成DNA的重要工具酶之一,并参与抗锥虫,,人们把HGPRT作为设计新型抗锥虫药的理想靶ll'.Allen等0先后研究了枯氏锥虫,短膜虫和布氏锥虫HGPRT基因的分子特性,并成功地进行了克隆和高效表达王祥生等一通过体外培养技术证明了伊氏锥虫HGPRT的生物活性,并通过化学诱变剂8一氮鸟嘌呤(8-AG),本研究利用RT—PCR技术从伊氏锥虫湖北水牛株总RNA扩增出HGPRT基因,并与T载体连接,转化大肠杆菌DH5,通过筛选鉴定,,,上海试剂二厂生产异硫***酸胍,巯基乙醇,N一十二烷基肌氨酸钠收稿日期:1090—04一Ol基盒项目:国家自然科学基金资助项目(39570549)作者筒舟:刘垒(1973,),男硕士购自上海生物工程公司;BcaBESTRNAPCRkit,购自大连宝生物工程公司;pGEMTEasy载体,TDNA连接酶,,42C融化后,,5d出现虫血症高峰,眼眶采血,用DEAE一纤维素柱分离虫体],:5一GAAGA—AGCTTGC一3';Primer2:5一CAT—GCTTGGCTTCTC一3cDNA的合成:2×Bca1stBuffer10L,25mmol/LMgSO44L,dNTPMixture(10mmo[/L)1L,RnaseInhibitor(40U/L),BcaBESTPolymerase(22U/uL)1L,Oligo—dTPrimer1L,,蒸馏水1L