文档介绍：第二节免疫分析方法及其应用一放射免疫分析法利用放射性核素可探测的灵敏性,精确性与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的一类免疫测定技术。:放射免疫分析(RIA)--以放射核素标记抗原与反应系统中未标记的抗原竞争特异性抗体的基本原理来测定待检样品中抗原量的分析方法。非竞争性结合反应:免疫放射分析(IRMA)—用放射性核素标记的过量抗体非竞争结合抗原,经固相分离,测定待测样品中抗原量的分析方法。、131I、3H、14C。3. 标记物的制备及鉴定标记物:是指通过直接或间接的化学反应将放射性核素连接到被标记分子上锁形成的化合物。要求:高比度、高纯度、完整的免疫活性、不能破坏抗原决定簇。直接标记法(铬氨酸残基和组氨残基)间接标记法(联接标记,引入添加基团)标记物的纯化:采用分离的方法—离子交换层析法。标记物的鉴定:放射化学纯度、免疫活性、比放射性(计算法和自身置换法)。4. 放射免疫分析一、原理:Ag + Ab AgAb + Ag +*Ag* AgAb + * Ag*Ag和Ab量恒定,Ag的量为一个系列浓度。竞争结合抗原抗体复合物与标准抗原的关系?*AgAb复合物的量取决于Ag的量?Ag量越大,*AgAb量越少?Ag量越小,*AgAb量越大?测量*AgAb量或测量多余*Ag量可推算出Ag量二. 标准曲线的建立?以*AgAb的放射性强度与*Ag的放射性强度的比值或以*AgAb的放射性强度与总放射性强度的比值作纵坐标,标准抗原浓度为横坐标做曲线,得到一条标准曲线。?在同样条件下测定样品,计算出抗原抗体复合物的放射性强度与总放射性强度的比值,在标准曲线上找出待测抗原的量。二、测量步骤?恒量的*Ag、Ab加入反应管中?加入待测样品、或标准品(已知浓度)?37℃或4 ℃温育?加入分离剂分离结合及游离部分?测定以总放射性为分母,测定*AgAb 为分子,计算结合%,以结合率为纵坐标,浓度为坐标,制作标准曲线?待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度0 2 4 8 16 32 64 12880 70 60 50 40 30 20 10结合%浓度二. 免疫放射分析方法?单位点IRMA:先将过量的标记抗体与待测抗原进行反应,形成抗原抗体复合物,反应平衡后,用固相抗原结合反应液中剩余的游离标记抗体,然后进行分离,测定抗原抗体复合物的放射量。?双位点IRMA:先用固相抗体与抗原反应,然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另外一个抗原决定簇结合,形成抗体-抗原-标记抗体复合物,分离出剩余的标记抗体,测定固相上的放射性。IRMA与RIA的比较高较高灵敏度高较高特异性高较慢反应速率抗体抗原标记物呈正比呈反比反应参数与待检抗原的关系非竞争性结合竞争性结合反应原理IRMARIA对表项目二. 荧光免疫分析方法?荧光免疫技术是以荧光素标记的特异性抗体或抗原作为试剂,用于相应抗体或抗原的分析鉴定和定量测定,主要有荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两种类型。?非均相荧光免疫测定法:需要分离抗原抗体复合物和剩余的标记物,然后测定复合物或剩余标记物的量,从而计算出标本中的抗原量。?均相荧光免疫测定法:不需要分离复合物与剩余标记物,直接测定剩余的标记物的量,计算出标本中的抗原量。