文档介绍：免疫测定标准化的难点在于蛋白的不均一性、基质效应、交叉反应以及需要测定接近测定方法下限的浓度等,所测定的免疫反应性通常是在糖基化、降解和复合形式上有差异的蛋白同种型的混合体。

(一)基质效应(matrixeffects)
免疫测定的基质效应通常定义为干扰抗原和抗体间反应但与分析物本身无关的非特异因素。基质效应与测定模式和抗体选择有较大关系,因此,其对不同免疫测定的影响方式也有所不同。基质效应通常由蛋白、盐、磷脂、补体、抗免疫球蛋白抗体(类风湿因子和人抗鼠抗体)、药物和可能污染样本的物质引起。这些效应可通过仔细的实验设计来减少,例如使用一定亚型的高亲和力抗体或抗体片段、降低样本对总测定体积的比例、在测定缓冲液中加入免疫球蛋白、理想的温育温度和较长的温育时间。免疫测定的校准物通常用类似于样本的基质的缓冲液制备,基质可为无分析物的人血清、无免疫学交叉反应抗原的动物血清或蛋白含量类似于样本的人工缓冲液等。因为血清的成分各有不同,每批血清基质的差异有可能会影响校准,因此以纯蛋白溶液作为基质较容易保持一致,但对于结合至血清蛋白的激素来说,除了人血清外,其他基质不能使用。

血清和血浆中总蛋白和盐的浓度相当稳定,但尿液中盐浓度则变化较大,盐浓度增加对抗原抗体间反应起一个抑制作用。如果样本体积小于总反应体积的10%~15%,则蛋白的影响不明显,但有时为提高测定的敏感性,常需一个较大的样本体积。因此,要求参考方法具有低的测定下限,且样本体积对总反应体积应小至足以排除大部分基质效应。

样本中的免疫球蛋白可通过与测定中所使用的特异抗体发生反应而影响测定结果。如自身免疫病患者常有可与抗体反应的类风湿因子(RF),针对动物免疫球蛋白的嗜异性天然抗体相当普遍,但一般情况下其浓度和亲和力较低。自身抗体和嗜异性天然抗体的存在通常会引起假阳性反应。这些干扰可通过加入足量的来自同一种系的免疫球蛋白而减小,也可在测定中使用抗体的Fab或F‘ab)2片段替代完整抗体来减小干扰,但如果样本含有针对试剂抗体的个体基因型(idiotype)抗体,则这种方法无效。这种情况下只有将免疫球蛋白从样本中去除或使用一个依据另一个抗体的方法测定。

各种补体成分均能与抗体反应,从而干扰试剂抗体结合抗原及与次级抗体反应的能力,在双夹心测定中可引起假阴性,在竞争抑制试验中引起假阳性。小鼠IgG2,和IgG2,免疫球蛋白亚型对补体的效应尤为敏感。可通过加热样本或在反应缓冲液中加入螯合剂来排除补体的干扰,但加热会影响很多的分析物,而螯合剂对诸如铕螯合剂和酶等非放射性核素标记物有干扰,因此倾向于使用对补体效应不敏感的抗体或抗体片段建立测定方法。

有报道称磷脂在类固醇测定中可干扰抗原的结合而引起结果的假增高,许多其他因子如血清分离胶中的成分、抗凝剂、去垢剂、药物、非酯化脂肪酸等对某些免疫测定也有干扰。

(二)抗原的不均一性和交叉反应性
蛋白激素显然是不均一的,其在血液循环中除了有生物学活性形式外,还有前激素、片段和亚单位。副甲状腺素(PTH)、ACTH及其前体、催乳素和促胃液素的大的形式以及生长激素的拼接变异体等均可引起测定问题。使用单克隆抗体的两位点双夹心测定大大改善测定的特异性,例如使用抗绒毛膜促性腺激素的。和p亚单位的单抗建立的双夹心方法将不会测定游