文档介绍：实时荧光定量PCR原理及其定量方法同济大学唐蔚实时荧光定量PCR原理和定量方法一、荧光定量PCR的原理在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程,对起始模板进行定量分析的方法。三个关键词:实时,定量,荧光1、定量与常规PCR的差别常规PCR技术:对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术:通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析2、荧光定量PCR常用的三个概念扩增曲线、阈值、CT值CycleNormalisedreporterFluorescence(Rn)BaselineExponentialphaseplateauphaseThresholdlineCtValueLinerphase(1)扩增曲线(Amplification)反映PCR循环次数和荧光强度变化的曲线。随着PCR反应的进行,每经过一个循环,收集一次荧光信号,通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化,从而得到扩增曲线图。纵坐标:Rn(荧光值)横坐标:cyclenumber(循环数)线性图对数图荧光信号变化与PCR循环数的变化直观!荧光信号变化的对数与PCR循环数的变化确定阈值线!(2)阈值(Threshold)在荧光扩增曲线上人为设定的一个值。它可以设定在荧光信号指数期任意位置上,一般荧光域值设置是基线荧光信号(一般是PCR3~15个循环荧光信号)的标准偏差的10倍。前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline)荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置:大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值;进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值(3)Ct值(Cyclethreshold)PCR过程中,每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时,所经过的扩增循环数。相同模板进行多次扩增,终点处产物量不恒定,但Ct值极具重现性。3、荧光定量PCR的数学原理Xn:第n次循环后扩增产物数量×在扩增产物达到荧光阈值时所经历的循环数为Ct个循环,此时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M×XCt:荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量,在阈值设定以后,它是一个常数,设为M上式两边同取对数得:LogM=LogX0×(1+Ex)Ct整理得:LogX0=-CtLog(1+Ex)+LogM