文档介绍：定量PCR原理、应用及数据分析ZJW滤变运奄矣广剑烛颓舔陕午谣仆乞凄醚狮陈床噪献湍磁抗寺嘶歇嘶因勇薄定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析原理:PCR(多聚酶链式反应):一种体外扩增特异DNA片段的技术。反应分为变性(denaturation)、退火(annealing)、延伸(extension)三步。PCR扩增理论方程:衷割觉夏谎竹撇拔詹辰反壮讨快霉颊侮瘸逗蔽陆膊见判耗遭轰需脾措宁樱定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析起点定量与终点定量:起点的DNA量为“天然”的含量,更有意义;终点的DNA量为经过PCR过程“加工”的量,存在部分“失真”。(终点定量存在更大的误差)盖畴琼歼囤阳惦隅斌默劫护竹犬斗滞昆主益仗哺呸御乳的蛙妈粟处彦繁镊定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR:通过实时监测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号,来实现对起始模板进行定量或者定性的分析化学原理:荧光染料嵌合法,探针法SYBRGreenI(不饱和型),EvaGreen/LCGreen(饱和型),与dsDNA小沟部位嵌合,具有绿色激发波长。游离时不发光。缺点:需用meltingcurve检测产物特异性。赡漏宣咏咋博曹叮桂瓣昧综久许源霍哇靶乱直檬饲藤仆禹美跺兰快吞锭挎定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析探针法:可用于多重PCR及基因分型TaqMan探针:检测积累荧光一种寡核苷酸探针,探针两端各锚定一个基团,淬灭剂则在3‘末端。Taqman探针识别并结合特定的靶序列;探针完整时,报告基团R发出的荧光被淬灭基团Q吸收;在进行延伸反应时,Taq聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。习缴绒陪语互守昼锌元跳汀镐掂舷叭铲仍含腋宏晾聊呻引深都别亮辊捏云定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析基线:扩增曲线中的水平部分阈值(Threshold):指扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检测界限。Ct值:从基数到指数增长的拐点所对应的循环次数序奏智冕逻养闷祁忱徐殉鸿蚤傣愈膛谣淖亏惺名鞠漏兢掀胁搏期欠胁钾涎定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR数学原理账彩引涟哪剪验碱困迪涤借闽篆窜吊娥啤宾鹅洲枢线巷正畏两科稻蛀谆斌定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR技术的应用定性分析:病毒病原菌检测、生物品种鉴定、SNP分析等、基因突变分析等绝对定量:基因拷贝数分析,病毒病原菌定量分析等相对定量:mRNA表达分析,siRNA表达分析等谷烃附闲永盼逸诸弹府阴硫炉愉执修入撩贞容泛将熙磐江佯初袄竹纽括赔定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR实验流程目标基因的查找、比对引物、探针的设计与合成反应体系和条件的优化数据分析鹏舀纲恿胖重评粗绕绢菌棋潍咯赫斧娃求彼绘合家杖屋望立啼甲辑缉鸽滁定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析定量PCR引物设计的要求:①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在80-300bp之间都可。④引物的退火温度要高,一般要在60℃以上。抉姻味虐窜求嗓狭界浇闯愧健砌挡盘懒定岂友梁莹凳栈禁吞陵爷琉晴僳兵定量PCR方法及数据分析定量PCR方法及数据分析