文档介绍：基因工程实验报告姓名:杜琳颖学号:学院:生命科学院专业:生化与分子实验目的学****并掌握从目的基因克隆到蛋白质表达的实验流程及原理。实验流程实验一、质粒提取载体DNA提取及酶切鉴定实验目的学****质粒的酶切及电泳分析。实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。目前,经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小,且具有超螺旋共价闭合环状的特点,从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有:碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理:利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋解开而变性,质粒DNA氢键也大部分断裂,双螺旋也有部分解开,但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型,而染色体DNA不能复性,形成缠绕的致密网状结构,离心后,由于浮力密度不同,染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点,并产生特异的切割,形成粘性末端或平末端,这样有利于DN***段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点,酶切后就能产生多少个片段。因此,鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断切点的数目;从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。实验材料、仪器及试剂实验材料含载体质粒pET28a的大肠杆菌试剂1、LB液体培养基2、质粒提取试剂盒(天根生物科技)3、TBE缓冲液4、点样缓冲液Loadingbuffer(10×)5、琼脂糖6、NcoⅠ酶,XhoⅠ酶(Takara)7、DNA回收纯化试剂盒(天根生物科技)仪器Eppendorf管、离心管架10,50,200,1000μL微量加样器Eppendorf台式高速离心机电泳仪系统恒温水浴箱凝胶成像仪摇床等实验步骤(一)质粒提取柱平衡步骤:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。mL过夜培养的菌液(已备好),,使用12,000rpm离心1min,尽量吸除上清,再收集一次菌体(根据浓度选择)。向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。向离心管中加入250μL溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μL溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min,此时在离心管底部形成沉淀。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm离心30-60sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。重复漂洗一次。将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA吸取4μL所提质粒,加入2μLloadingbuffer%琼脂糖凝胶中,电泳20min左右后拿出放入凝胶成像系统,根据图像判断所提质粒浓度及质量。质粒载体DNA酶切按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中。加样后混匀,置于37℃水浴中,保温5h。吸出8μL酶切产物,加入2μLloadingbuffer混匀后点样琼脂糖凝胶电泳,鉴定酶切是否正确,两个酶切位点之间片段大约150bp左右,理论上双酶切电泳应出现两条带,一条较亮的长片段和一条很暗的小片段。而单酶切只出现一条带,即线性化载体。同时应点样质粒作为阳性对照。确认酶切正确后,在酶切产物中加入loadingbuffer终止反应,准备胶回收。载体片段的获得取酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测确认酶切完全后,然后进行载体片段的回收。制备胶回收的琼脂糖凝胶。将双酶切样品加入点样空中,进行电泳分离。将凝胶板染色后,在凝胶成像仪中切取D