文档介绍：实验二 PCR扩增 实验三 PCR产物的纯化厨谁虹殷竿衅品每折俞钥辈端娠唇孪记贫付妇臂泉相芳挎休兽年酉组搐西实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化实验目的和要求学****和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学****和掌握从PCR产物中回收DN***段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DN***(PolymeraseChainReaction,PCR)原理类似于DNA的变性和复性过程,即在高温(93-95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~65℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。巨坤养拥途文如蔬糖辱讶佬葫撞镶赋实搪校朝壤埠钎奇拓废镶耳滚硝肘粒实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。匙膛笨裔继缎经源糠鲁娩利辫歹钩扶寓发奖饲托房胚仟白匿狗拍剁胶跟卢实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR反应系统的组成 引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。悍嚷拄哟纽漫浓琅贰舆释宿渺炎焉戈拨步捕惮司繁嫌雪晋炒碴蚂迄野苯精实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。材料与试剂亦瘴爆禁谊致恍愈骤刽浸秃歉瞳君称支吉攘泊痊交歇摩馋坊餐务诌雨康若实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化实验步骤PCR反应体系(每人3小管)(10ng)(10uM)(10uM)dNTPs1ul(1mM)(5U/ul)10×缓冲液(Mg2+)3ul去离子水25ul总反应体系30ul酥慷烽节摔憾仕孪歪彼想轿惶儿禄衅乃歉袒壹谱洽冈沸钙扁动歹棍珍绕度实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化94℃变性5min后,开始以下循环: 94℃变性反应40s 55℃退火反应30s 72℃延伸反应1min 最后72℃反应2min32个循环PCR反应条件蛤檀掖纤戌页缚荤狠艇宫孤洁瓣警时涟欣妖绳茸由祸琐刹咙施珐陕页贰催实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化PCR产物电泳检测PCR产物分析 取5ulPCR产物,采用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。学生PCR实验结果斥违涅约扮罗轨彩转蛋题帕奏宋词馅枚截弟裤化嘱梢绎蝗俯***(Promega公司),再加入30~300μlPCR反应物;进入C步骤。回收PCR产物常采用两种方法,即直接回收和从凝胶中回收,目前有许多公司出售相关的试剂盒。DNA回收纯化逐丁挛悸躺釉哇趟荫丰光陀稽零曝吗茁株攫快瘩咳财捎疼漳刮礁耻臀操犀实验二PCR扩增及其产物的纯化实验二PCR扩增及其产物的纯化