文档介绍：· · 中国运动医学杂志年月第卷第期,,.,.
—融合蛋白的表达、纯化及其跨膜转运功能鉴定
尚西亮陈世益任惠民李云霞陈疾忤华英汇’
复旦大学附属华山医院运动医学科上海复旦大学神经病学研究所
摘要目的:构建含有及不含有的质粒表达载体,并进行诱导表达、纯化,在体外初步鉴定
.的跨膜转运功能。方法:,分别重组
入质粒表达载体中,测序鉴定后转化大肠埃希菌,构建重组体的表达菌株;诱导表
达后,用. 亲和层析柱分离纯化融合蛋白,纯化产物进行. 分析、鉴定及磷酸酶
活性染色;然后分别以/纯化的及—孵育成肌细胞,间接免疫荧光法检测两
者在细胞内的分布情况。结果及结论:成功地构建了含有及不含有的质粒表达载体;转化大肠埃希
,
和酶活性染色鉴定表明成功地获得了两种融合蛋白;间接免疫荧光染色显示,.孵育组细胞内可
见有较强的绿色荧光,而组细胞内则未见荧光,表明可介导由胞外跨膜转导进入胞内。
关键词碳酸酐酶;融合蛋白;纯化;蛋白质转导域
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有研究显示,肌肉基本化学物质的改变是肌肉收缩消除疲劳呢要研究这个问题,首先要解决如何将
速度与强度改变的基础⋯。我们在前期研究中已发现,急转导进入细胞内。然而,由于细胞膜的屏障作用,蛋白质
性大强度跑台运动及低频电刺激诱发大鼠运动性疲劳后等大分子物质难以进入胞内,这对研究的功能造
均可引起相应骨骼肌碳酸酐酶, 成了一定的困难。近年来,蛋白质转导技术的发展使蛋白
表达下调,鉴于具有的多种生理作用似乎都质治疗成为可能。蛋白质转导是通过称为蛋白转导域
能影响骨骼肌的功能,因此,我们认为运动性疲劳的发生,的肽段实现的。
可能与骨骼肌运动时的减少或消耗有关。如果最初发现于人类免疫缺陷病毒的蛋白中,其
事实如此,那么对疲劳的骨骼肌补充是否有助于核心序列为。不仅能够介导与之相
基金项目:国家自然科学基金资助项目
通讯作者:陈世益,: .;:—
中国运动医学杂志年月第卷第期,,.,. · ·
连的多肽或者全长蛋白质跨膜进入胞内,而且能使进人.. 重组蛋白的表达与纯化
胞内的生物大分子保持其原有的生物活性。鉴于此, 将鉴定正确的表达菌..,接种于含
,℃振摇过夜,次日按
序列的质粒表达载体,并表达纯化出融合蛋白,体外初步体积比:接种于新的培养液中,培养至对数生长
。期后加入至终浓度为./,℃继续培养
材料与方法后离心收集细菌,漂洗次。将收集的细菌重悬于裂
. 材料解缓冲液/,/ 咪唑,/
.. 质粒、菌株和细胞株,%甘油,/,.中,冰浴条件下
原核质粒表达载体、大肠埃希菌菌株、超声波破碎细胞,、/离心,弃上清,沉淀用
均由复旦大学神经病学研究所提供。/尿素缓冲液/,.,./
成肌细胞株购自中国科学院上海细胞库。—,.溶解,室温、/离心,收集上
.. 主要试剂清。然后在变性条