文档介绍：SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰***凝胶电泳聚丙烯酰***凝胶电泳,简称PAGE,是以聚丙烯酰***凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰***凝胶由单体丙烯酰***和甲叉双丙烯酰***聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四***乙二***(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰***单体聚合,同时甲叉双丙烯酰***与丙烯酰***链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,Tris-HCl。Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,可以有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCl解离成***离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中***离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时***离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。聚丙烯酰***凝胶电泳作用原理聚丙烯酰***凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰***凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰***凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰***凝胶,在电泳的过程中,蛋白质可以保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰***凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。二、实验目的。。。三、实验原理带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。在一定的电场强度下,分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。聚丙烯酰***凝胶(PAG)是由单体丙烯酰***(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰***(Bis)在加速剂四***乙二***(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP)的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。PAG机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后,所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。当蛋