文档介绍：郑州大学
硕士学位论文
不同亚型成体骨髓干细胞向肝细胞诱导分化的体外研究
姓名:李文晰
申请学位级别:硕士
专业:消化内科
指导教师:段芳龄
20030420
郑大学士毕业论文不同亚型蒯本骨髓干细胞向肝细胞诱导分化的体外研究
不同亚型成体骨髓干细胞向肝细胞诱导分化的体外研究
研究生李文晰
导师段芳龄
郑州大学消化疾病研究所
河南郑州
摘要
几十年前骨髓干细胞应用于临床的研究还仅集中于治疗血液系统的疾病白血
病、地中海贫血方面而近几年来随着研究的增多和深入,逐渐发现了骨髓干细
胞的多能性,骨髓干细胞不仅可分化为血细胞,还可跨越胚层的界限分化为皮肤、
心肌、神经元等细胞。自此掀起了一场骨髓干细胞研究的热潮。年等
研究发现骨髓细胞有分化为肝细胞的潜能,自此骨髓干细胞向肝细胞分化的研究逐渐
展开,开拓了肝病治疗的新思路一将骨髓干细胞用于治疗肝病。但目前人们对这方
面的研究还不够深入透彻,还存在一些问题阻碍着干细胞的研究和应用。骨髓中分化
为肝细胞的究竟是一类定向肝前体细胞,还是更原始的干细胞骨髓中是否存在一
类更易分化为肝细胞的干细胞亚型如何筛选出这类细胞都还没搞清楚。虽然很
多研究分别发现不同亚型的骨髓干细胞可分化为肝细胞,但尚无人比较它们向肝细胞
的分化潜能是否相同。另外骨髓干细胞定向分化的机制,体外诱导骨髓干细胞定向
分化的条件都还没搞清,形成了目前研究中的一大关碍。基于目前研究的现状,本
课题旨在比较有代表性的三类骨髓干细胞骨髓单个核细胞全骨髓干细胞、
造血干细胞非造血干细胞向肝细胞分化的情况,以便筛选
骨髓中是否存在一类更易向肝细胞分化的细胞。另外通过观察两种生长因子的作用
及其相应受体的表达情况,探讨这些因素在骨髓干细胞向肝细胞定向分化中的作用,
并从一定程度上探讨分化的机制。
材料与方法
骨髓细胞来源于健康志愿者的胸骨或骼骨,年龄岁。本实验分三组组
骨髓单个核细胞组组细胞组组一细胞组。组细胞通
过密度梯度离心获得,用苏木素染核检测分离出细胞的纯度。两细涌讨
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式分离而得,用】〕染核检测分离出细胞的纯度。每组细胞均用四种诱导培养基
分别为含单独肝细胞生长因子、单独
,纤维母细胞生长因子一十和不含生长因子
的进行培养。
分别留取新分离的细胞及各组培养天、天、天、天时的细胞,备作
糖元染色和免疫组化检测肝系细胞分化的标志、白蛋白,
检测新分离的细胞及组细胞不加生长因子或加诱导培养天、天
时。受体、受体的表达情况,并比较各组细胞
间表达有无差异,及生长因子诱导后表达有无变化。
统计学分析各指标的阳性率在不同时间点、不同组、不同处理因素之间的比
较,用卡方检验,判定为有差异。
结果
密度梯度离心法分离的骨髓单个核细胞,在倒置相差显微镜下观察,细胞大
小均匀,透亮度好,台盼蓝染色,细胞活率。苏木素染色未发现双核或多核细胞。
磁式分离所得细胞,在倒置相差显微镜下观察,细胞大小均匀,透亮度好。
台盼蓝染色,细胞活率细胞,标记的细胞占细胞总数的。
细胞自小时起开始有贴壁,之后逐渐增多。细胞呈克隆型生长。细胞达对
数生长期的时间随供者不同而有差异。
细胞培养过程中观察发现与对细胞生长的影响差别不大,而二者
联合使细胞增殖速度要稍快。
三组细胞用含生长因子的培养基培养后均可检测到肝系细胞的标志,
而不含生长因子的培养基培养后未检测到。
统计学分析显示,、白蛋白、糖元这四个指标的阳性率在三组之
间均无明显差异,在单独、单独或十三种处理因素
之间也无明显差异。但各指标的阳性率随着培养时间的变化而变化
。
产物的电泳结果显示,的产物在新鲜分离出
的三种骨髓干细胞均有微弱条带,且三者亮度无明显差异。组细胞用含
郑州大学年硕士毕业论文不同亚型成体骨髓千细胞向肝细绷碍别的体外研究
的培养基培养天、天时其条带较新分离时亮,而不加生长因子培养后条带亮度
则无明显变化。
结论
密度梯度离心法适于分离骨髓单个核细胞,且活率和纯度均较好。
磁式分离技术分离细胞,纯度很高,活性不受影响。
人骨髓单个核细胞、细胞、一细胞均可在体外诱导分化为具
有肝系细胞表型和功能的细胞,且三者在本试验的诱导条件下向肝细胞分化的潜能
无明显差异。
都能诱导骨髓干细胞分化为具有肝系细胞表型和功能的细胞,且
二者在一定程度上有联合作用。
在新分离的人骨髓单个核细胞、骨髓干细胞、
一骨髓干细胞均有低水平表达,加生长因子诱导培养后表达水平增高。生
长因子与其