文档介绍：中国協和医科大学
硕士学位论文
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)聚合酶细胞外复制模
型的建立和抗丙型肝炎病毒药物的筛选应用
姓名:杨振
申请学位级别:硕士
专业:微生物与生化药学
指导教师:蒋建东;祁自柏
三羟甲基甄基甲烷免疫印迹法嗜热菌
、赴飧粗坪嵝偷慕⒑涂笻病毒药物的筛选应用摘要丙型肝炎病毒琀腥诀鹗漪蟾窝椎淖钪鹘≡澹瑟漆工作是摆在我懿磷蓊豹焱爱豹螽务。ろ韭洞蓝嗟宦断ぬ俦硐郑栊闫鞑《携带者和急性肝炎,丽%一%的腥菊叻⒄刮B愿窝祝⒈冉峡斓亟刮8斡交和瓣癌等终末期翳臻。由子谈乏理繇酌没搴槿舅跷饶P停圆《镜呐耨蜓赝致病作用,抗病毒治疗和疫苗的制备等研究受到限制;同时缺乏理想的腥镜亩锬粗浦衅鸸丶饔玫拿附⑾赴獾拇琳庑┟肝0点的分子模型。本研究建立豹】﨨酆厦父僬樟绶肿痈粗颇P停谰堇丛从鐷聚合酶在粗浦兴鸬墓丶饔谩鞍资荝依赖性的嗑勖硬究谖明,重组疑摸板萼咐刁叮冒缛繦毫吹暮铣伞@砺凵辖玻瓒显诓《靖粗浦芷诜⒒庸丶饔玫腘酆厦福霹静铡病毒复籍,楚我靛开震撬病毒药耪磅袭熬有竭工爨巍璎论依据。本研究按常规方法进行反转录及套式┰觯褂酶弑U鍼酆厦福匀〈崦福跎倮┰鍪奔钭氪砼洌孜夜鷠￥柰菅G逯欣┰龀鯤聚酶序列,纯化铩>瑽和盖校淇寺≈。构建了原核表达载体狢蚿2庑蚪峁砻鳎爰悍⒈淼南喙豀酆厦感蛄斜冉希浜擞窈桶弊媵缺3葱苑宙瘴:滓骣及。骘之闫。在多个载体中选取作为表达载体,实验表明此载体为松驰型质粒,可在宿主细胞中表达条件下,诱导表达融合蛋白脀ḿ觳庋罚苡際酆厦镐煌漪だ氡泶镨笛%。我稻裁弼金属离子亲和层析将其纯化,得到了纯度大于.%的酶擞自;对该酶相关的分子生物学参数,化学结构和二级结椅迸行分析,与有关报道院较,也表明我们表达的爝自是一甃,加入瓣玌撂记生物素,燕入我冀泶锉狧型,丽内外的科学家开始利用迫踉嶂肇掣蠢瓅貔,起动大量扩增,有效舞褰泶锍衅剑卮煤鬼罢癌凌子可增强转滚莛戆羧率。在簸德单抗反应,证竣萁梵鬃鑫,两懿其有聚合酶蛋白。模拟酆削邝綱存斩缘纳砘肪常眉怨鶦公司酣着嘌澹桓輙籒结构设计的捕捉模板一白~綦合研究生蒋建永研究员导师杨振祁自柏研究员
然后进行酶动力学研究,探索了不同反应时间的产物鸯成量,分别制成产物生成量一时间的反应速度,制定反应速度一酶量曲线,在线性范围内,选择适宜的酶量测定酶活性。。。洲醋酸镁,酶蛋白,在聚合酶作用下合成∽毫矗尤肭缀臀杀昙堑睦背饭趸锩福胍押铣傻怒￥负链中的狭体惚I锼胤从Γ热牒成ḿ两邢陨ǎ妹覆胍遣舛ú锷闪俊我们还时反应中捕捉横板、、值及魇应温度婷相关影响反应的因素进行测定,逡簿往他湛凌秘癌等袈锌,建立了刍狩跤О局辗钟梵盘夏P拖隆蘧线,程共同静线性范溺内,确定反痰游闻;又在反陂系统审改交酶鬃,灞定不闲酶爨对加入不嗣的候选抑制剞,根擐各抑制剂不同浓度下的抑制率求出对酶的%抑制浓度和%抑制浓度‰陨秆∫种萍痢N颐欠⑾忠┪颎的%抑制浓度为在经过重麓实验届,我们建立了酆赶赴夥肿痈粗颇D郏渥钣琶键反瘦髂系条绛魏下:发应滚体积;鏻,发应滚戒份:磷侥E眩琲然浚酘缓冲液,各厶福妫从钟,弃液,洗扳三次。加入篿缀退乇昙堑睦备趸锩福,反应分钟,弃液,洗板三次。加底物及底物缓冲液各7跤缍任7跤奔湮。期终止液,终业液俸积:。根裾鞠前实际使用和操作,我们认为本研究所建立的分子酶活性模型梢杂美瓷秆】笻病毒药扬,著霹以戎戈寒来裹邋量戆选蕊夔瑟瑟疆,壤羚了溪蠹暖￥缎戆癸赛镬模型磺宪关键词:丙性肝炎病毒得不同批次聚合酶的米氏常数分澍为:.;.;.铡的空白。糕因克隧基因表达酶活性籙,珿,,痬
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复制体的形成——正负链’端茎环结构的保守序列可通过结念细胞蛋白与病毒非前言嚣蒋台斌受链В咚硎湍焯巫臃黼合戏镤馥,经薪辩筻锱捧盒成多个予我正蘩囊;◇簿臻褥骚鑫,稳糕、萅噋,楚参与癌簿笈鬟帮最毒冀键螃藐翁蛋爨舅一熏要藜氟楚在密圭髂蠹数“准耱”黟式存在”。,瓣霹一拣瘸毒在密主敫粗瞥羖了关键铣芍馄鹬行拇莼貅筚W疗餮啄舭还鲛夷旄蛹膊』嵋椋槿啡旆坪狈且姻嗜貉子嗝A伥琀直径约恢嗤馓螅琀为单股篺三涨廑瘸寤,基黻全长辫,由┒耍’末端帮位于两个末端之辩的荦~开藏读弱框絮厝霾糠侄谐伞啊w胍淮够蔕长约,缡羁个氨基羧,豁病毒多蛋蛊。这一大的病灏疆白前体,经宿燕基因和病毒藏因编码的蛋爨蘩等~系爨酶锈骖绛,影戎夫夺不惩帮凌黥不~麴瘸毒蛋自,分燕瓣太类,①结稳爨逡,位于┒耍ê诵牡