文档介绍：山东农业大学
硕士学位论文
Paraconiothyriumvariabile GHJ-4漆酶的发酵、分离纯化及其
酶学性质的研究
姓名:王维乐
申请学位级别:硕士
专业:特种经济动物饲养
指导教师:牟志美
2011-06-10
山东农业大学硕士学位论文
中文摘要
漆酶(ase,EC )是一种含铜的多酚氧化酶,具有广泛的底物,不仅能催
化氧化多种芳香族化合物,还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质如苯氧基类除草剂
等的毒性,还可以使多种染料脱色及去除石油工业废水的毒性;因此在造纸、环保、食
品、医药卫生、生物检测等领域具有较大的研究和应用价值。鉴于此,以本实验室筛选
到的一株高产漆酶菌株 Paraconiothyrium variabile GHJ-4 (简称:GHJ-4)为研究对象。
采用统计学方法对 GHJ-4 菌株产漆酶的发酵培养基及发酵条件进行了优化,并进一步
对菌株 GHJ-4 所产漆酶进行了分离纯化及其酶学性质的研究,主要内容如下:
1. 通过摇瓶培养,结合统计分析方法研究了发酵培养基和发酵条件对 GHJ-4 产漆
酶活性的影响。
通过单次因子试验和正交试验确定了发酵培养基的最佳碳源、氮源、碳氮比、无机
盐。在此基础上,通过响应面法对发酵培养基进行优化,首先采用 Plackett-Burman(PB)
试验设计筛选出了影响该菌产漆酶的三个重要因素:可溶性淀粉、牛肉浸膏和 CuSO4;
继而采用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,并结合中心组合试验以及响应面分析,建立
了以漆酶酶活为响应值的二次回归方程模型,从中获得了最佳发酵培养基为:麸皮 30
g/L,可溶性淀粉 g/L,牛肉浸膏 g/L,NaNO3 1 g/L,KH2PO4 3 g/L,CuSO4
g/L。
在优化后发酵培养基的基础上,结合统计分析方法对发酵条件经了优化,首先用
PB 法筛选出四个影响较大的因素,即接种量、培养时间、装样量和转速;继而采用最
陡爬坡试验逼近最大响应区域,并结合中心组合试验以及响应面分析,建立了以漆酶酶
活为响应值的二次回归方程模型,从中获得了最佳发酵条件为:接种量 %(v/v),
温度 28℃,初始 PH 4,培养时间 182 h,装液量 mL/250 mL,转速 157 r/min,种
龄 96 h。
采用最佳发酵培养基和发酵条件,供试菌株的漆酶酶活达到 U/mL,较优化
前漆酶的产量提高了倍,其试验值与预测值基本相符,说明预测模型可靠性高,
可应用于漆酶发酵条件的优化。
2. GHJ-4 漆酶的分离纯化及其酶学性质
菌株 GHJ-4 液态发酵所产的漆酶通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-sepharose Fast Flow
阴离子交换树脂、Sephadex G-75 分子筛柱层析三步分离纯化后,得到电泳纯的漆酶,
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Paraconiothyrium variabile GHJ-4 漆酶的发酵、分离纯化及其酶学性质的研究
纯化倍数为倍,回收率为 %,其分子量约 53 kDa。
纯化后的漆酶最适温度和最适 pH 分别为 50℃和 ,该酶在 55℃以下 ~
范围内较为稳定;Cu2+、Mg2+、Zn2+对漆酶酶活有明显促进作用,而 Hg2+、Fe3+、Ag+
对漆酶酶活有显著抑制作用。以愈创木酚为底物时,测定该酶的米氏常数 Km 值为
µmol/L,最大反应速度 Vmax 为 mmol/(L·min)。

关键词:Paraconiothyrium variabile GHJ-4;漆酶;发酵;分离纯化;酶学性质

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山东农业大学硕士学位论文
Fermentation, purification and characterization of ase from
Paraconiothyrium variabile GHJ-4
Abstract
ase is a type of multi copper-containing polyphenol oxidases capable of oxidizing a
wide range of polyphenols and other lignin-derived pounds. ases can
degrade lignin and phenoxy containing he