文档介绍：第三部分鉴定技术生物活性分子的分离与表征第10章、电泳技术第11章、定量分析技术第12章、组分分析技术第13章、生物活性测定技术第11章、定量分析技术一、紫外吸收法二、Bradford法三、BCA法四、如何选择合适的蛋白定量方法?物理性质:紫外吸收法?化学性质:Folin-酚试剂法(Lowry法),BCA法(Bicinchoninic acid法),凯氏定氮法,双缩脲法(Biuret法),胶体金测定法,等等?染***质:考马斯亮蓝染色法(Bradford法)、银染法测定绝对含量应用凯氏定氮法(蛋白质的含氮量为16%)。蛋白质的定量分析方法蛋白质在紫外光区(190nm-360nm)有两个强烈吸收峰:280nm和190nm。 280nm有吸收的电子所需能量较少,因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中,色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环,可吸收280nm波长的光子,苯丙氨酸(Phe)也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关,因此相同浓度的不同种类蛋白质,其280nm的吸收值差别很大(图1)。一、 /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱图B是10μg /ml RNA和DNA的吸收光谱。?280 nm光吸收法:根据吸光值或蛋白质摩尔消光系数ε的文献值,可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。如果已知某一蛋白质在280 nm处的摩尔消光系数(ε),测定蛋白质溶液280 nm吸光值后,根据公式:c =A/ε,可直接计算出蛋白质浓度。?280 nm和260 nm吸收差法:若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的核酸类物质,用280nm来测定蛋白质浓度时,会有较大的干扰。由于核酸在210 nm的光吸收比280 nm强,因此可利用280 nm及260nm的吸光值之差来计算蛋白质的浓度。常用下列经验式估算:蛋白质浓度= A280nm - A260nm(mg/mL)假设1 mg/mL蛋白质溶液的A280nm为1。?215 nm和225 nm的吸收差法:蛋白质的肽键在200-250 nm有强的紫外线吸收。其光吸收强弱在一定范围内与浓度成正比,且波长越短,光吸收越强。若选取215 nm可减少干扰及光散射,用215 nm和225 nm吸光值之差与单一波长测定相比,可减少非蛋白质成分引起的误差。因此,对稀溶液中蛋白质浓度的测定可用215 nm和225 nm光吸收差法。常用下列经验式估算:蛋白质浓度=(A215nm - A225nm)(mg/mL)优点:?不需添加任何试剂,因而对样品没有任何破坏;?测量极其简单迅速;?蛋白浓度和吸光度是线性关系,容易计算。?适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。缺点:?干扰测定的影响因素多,尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收, 所以一定要考虑样品中是否有核酸。要得到准确可靠的结果,必须严格控制样品溶液的pH和化学组成,使待测样品和标准样品的实验条件一致。?敏感度低,要求样品的浓度较高,量较大。?用标准曲线法测定蛋白质含量时,对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,误差较大。