文档介绍：细胞传代培养及细胞计数细胞传代培养及细胞计数人癌细胞系传代培养人癌细胞系传代培养??1. 1. 观察:观察:培养细胞生长活跃,占瓶底培养细胞生长活跃,占瓶底80%-90%80%-90%,无污,无污染;染;??:弃废液:倒掉瓶中培养液,尽量沥干液体;倒掉瓶中培养液,尽量沥干液体;??3. 3. 漂洗:漂洗:加加1ml1ml % %胰蛋白酶消化液漂洗胰蛋白酶消化液漂洗11次次,,弃去消弃去消化液;化液;??4. 4. 消化:消化:再加再加1ml1ml消化液漂洗消化液漂洗11次次,,倒掉大部分消化液倒掉大部分消化液, , ,,室温放置室温放置33~~5min5min;;??5. 5. 吹打:吹打:镜下看到细胞收缩变园镜下看到细胞收缩变园, , 加加11~~2ml2ml含血清培含血清培养液养液, , 用吸管按顺序轻轻吹打,避免出现泡沫;用吸管按顺序轻轻吹打,避免出现泡沫;??6. 6. 计数:计数:取样取样,,计数计数,,调整细胞浓度;调整细胞浓度;??7. 7. 接种及培养:接种及培养:按按101044细胞细胞/ml/ml接种接种,37,37℃℃、、5%CO5%CO22,饱,饱和湿度条件下培养。和湿度条件下培养。注意事项注意事项??细胞生长至覆盖培养瓶底面积细胞生长至覆盖培养瓶底面积80%80%左右时左右时,,开始传代。开始传代。??首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。首次传代培养应适当提高接种细胞浓度。??细胞混杂生长时细胞混杂生长时, , 可根据需要选择合适的可根据需要选择合适的方法纯化细胞。方法纯化细胞。血球计数板法血球计数板法??制备细胞悬液:制备细胞悬液:细胞密度>细胞密度>101044/ml, /ml, 细胞过细胞过多时需适当稀释多时需适当稀释,,单个细胞率单个细胞率>95%>95%。。??加样:加样:混悬细胞,取少许细胞悬液,从计混悬细胞,取少许细胞悬液,从计数池一侧加入,不要溢出或出现气泡。数池一侧加入,不要溢出或出现气泡。??计数:计数:1010倍物镜下计数四角大方格内的细倍物镜下计数四角大方格内的细胞,压线者只计左边线和上边线。胞,压线者只计左边线和上边线。??计算:计算:细胞数细胞数/ml=/ml=(四大格细胞总数/(四大格细胞总数/44))××101044××稀释倍数稀释倍数细胞活力测定-台盼蓝染色法细胞活力测定-台盼蓝染色法??制备单个细胞悬液:制备单个细胞悬液:101055~~101066//mlml??染色:染色:%%台盼蓝染色台盼蓝染色1 min (91 min (9滴细胞悬液+滴细胞悬液+%%台盼蓝台盼蓝)),,3min 3min 内计数内计数??计数:计数:用血细胞计数板镜下分别计数活细胞(染用血细胞计数板镜下分别计数活细胞(染料拒染)和死细胞(呈淡蓝色)料拒染)和死细胞(呈淡蓝色)??计算细胞活力:计算细胞活力:活细胞率(%)=[活细胞数/(活细胞数+活细胞率(%)=[活细胞数/(活细胞数+死细胞数)]死细胞数)]××100100