文档介绍：中国协和医科大学
博士学位论文
人DR5胞外区结构和功能的初步研究
姓名:陶晓辉
申请学位级别:博士
专业:生物化学及分子生物学
指导教师:郑德先;刘彦信

摘要氖芴澹彩前邢蜓芯肯赴蛲鐾揪兜闹匾受体。研究榈嫉牡蛲鐾揪恫⒃擞糜谥琢鲋瘟剖歉昧煊虻娜鹊恪1实验室的前期工作发现馇慕峁购凸δ芨丛樱币蔡峁┝搜究男矶嘤攀铺跫1臼笛槎匀薉胞外区的结构和功能进行了初步的研究:构建了馇煌峁褂虻脑嘶虮泶镏柿#泶纯化得到不同结构域的蛋白,利用本实验室制备的馇タ寺】体分别和这些受体的蛋白进行结合实验,初步推导了各结构域的功能和生物学意义。首先,用砑訢胞外区抗原决定簇的结构进行分析,依照抗原决定簇的结构,将馇来畏治个片段杓瓶寺”泶锓桨福寺”泶个相互重叠的片段,.—,尽可能保留这銮虻慕峁购凸δ芴氐恪R员臼笛槭抑票傅馇嘶虮泶镏柿ND0澹杓对铩=玃产物连接入甌载体,用内切酶和覶载体上切下目的片段,再连接入原核表达载体產,转化进入宿主菌,分别获得带有鲎榘彼嵊隖、.形成的融合蛋白工程菌。在诱导下,龉こ叹寄芄桓咚奖泶颋、.融合蛋白。甈治霰砻鳎現、.在超声上清中都存在,是甊疶
是保护和连接作用。结合蚼的肿瘤杀伤活性特点,我们提利用金属离子螯合树脂琋缀筒阄鲋炕螅获得初步纯化的重组融合蛋白。将馇约癋、.分别和本实验室制备的做结合实验,发现隩结合时存在两个亲和位点,高亲和位点的值为颓缀臀坏愕腒滴,并且证实高亲和位点位于,,所以我们推测低亲和位点位于。利用本实验室制备的多株胞外区虵、—分别作岷鲜笛椋⑾执蠖嗍抗体结合和。然后用再次定性证实⒏髦阭的结合位点。本实验室发现,这些校街昃哂杏隩相似的肿瘤杀伤活性,,我们推测了人馇煌峁褂虻墓δ埽現侵饕=榈细胞凋亡的区域,有重要的辅助功能,主要起保护作用,主要出了厶搴拖赴砻鍰的作用模式,分析了馇同结构域在该模式中的角色,认为在厶搴虳结合启动凋亡的过程中存在正协同作用。关键词:珼,凋亡,结合位点
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直怀莆狝涮在哺乳动物中,有两种相互关联的途径启动细胞凋亡,一条途径涉及凋亡喑莆3绦蛐韵赴劳,是多细胞动物生命历程中的一个关键机制,既出现在个体发育过程中,也出现在正常生理状态或疾病中;既在体内发生,也出现在体外培养物中。凋亡贯穿于机体的整个生命过程中,参与严格地调节细胞生成,阻止各种病理性改变,例如癌症、免疫缺陷和自身免疫反应。到死亡受体与肿瘤坏死因子易宓慕岷希硪惶跬揪渡婕跋赴谻从线粒体的释放。死亡受体途径是由易宄稍逼舳珩羰姓庑┡涮宥际峭ü相应的受体相结合而作为细胞外因素引起凋亡,浚庑┮嫉蛲龅氖芴和,,例如鹕耍珺家族的促凋亡因子和抗凋亡因子在线粒体表面通过竞争调节细胞色素氖头且桓的型跨膜蛋白,它的胞外结构域能够被蛋白水解从细胞表面切除。正如大多数猺包括、—/,猺,俊猧
肿瘤治疗方面的应用。而梢砸鹛逋庵诙嘞赴档牡蛲觯易宄稍币谎琓形成同源三聚体与三个受体相结合,每一个受体处于两个堑ノ恢鋄,W魑猅超家族的成员,陌馇蚑超家族的其他成员有很高的氨基酸同源性:、猀、淋巴毒素一%壬馨投舅兀%们都可以通过死亡受体途径启动变异细胞和激活的淋巴细胞的凋亡】。和猀对正常组织有急性毒性作用,抗固寤岬贾轮命的肝损伤,б蛭S屑せ钛字⑶癗甂B家蜃拥哪芰Χ导致致命的炎性反应,这些并发症严重限制了这些凋亡诱导配体在抗几种因为职┗蛲槐涠曰苹蚍帕莆扌У闹琢鱿赴礫,对多数正常组织却没有杀伤作用,显示出其可能是一个强有力的抗肿瘤药物【】。系统的给小鼠和非人类的灵长类动物注射重组人鞍能有效的提高对肿瘤细胞的凋亡诱导活性,对正常器官和组织没有明显的细胞毒性。此外新发展的瓺抗体在体内体外都显示了很强的抗肿瘤杀伤活性,而且毒副作用更低。至少已有五种芴寮罕环⑾郑琓.//,饬街质芴灏嬖谟诎乃劳鼋峁褂,⑶./、/和这三种假受体缺少有功能的,因而不介导并且能够阻断凋亡信号的五种受体在它们的细胞外配体结合域有高度的同源性。很多肿瘤细胞系优先表达
甊蚑.,.这表明了死亡受体和假受体的不同调节。目前,靶向难芯恳丫枪赜赥介导凋亡的研究热点和趋势,对陌邢蜓芯肯猿龆喾矫娴挠诺鉡J紫染蠖嗍琢鱿赴比正常细胞在细胞表面表达更高水平邢駾增加了对肿瘤细胞的选择性。其次,蠨,礁鏊劳鍪芴澹堑囊煨交联可能会引起正常细胞的凋亡,导致肝细胞毒性,靶向囊┪锟以在具有很强抑瘤活性的同时避开跋靃】。第三,,,黾偈芴澹琓诱导肿瘤细胞凋亡的能力可能会因为假受体的存在而减弱,并且和假受体的连接可能会导致麻烦的副作用,例如:隣