文档介绍：中国协和医科大学
博士学位论文
人突变apoE转基因小鼠疾病模型及其基因表达特点的初步研究
姓名:薛越强
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:吴宁华;琦祖和
中文摘要鼠系。铝渥;蚴蟮难V铰愿哂诙哉帐螅琘一迷宫实验表明铝渌;部分削减克隆经序列测定和同源性比较后,发现鑫粗;虻钠危渲个新砘颍珹淼鞍是一种重要的载脂蛋白,其在脂质代谢中的作用早已被人熟知。最近的研究表明是~个具有多功能的分子,可以在细胞生长,胞内信号传导,糖代谢,神经元的生长和修复等生理过程中发挥作用。而且,硇突贡蝗范ㄊ窃缋闲猿沾⒉〉奈O找蜃又ǎü不同异构体与发病风险的研究,激发了人们研究神经生物学功能的兴趣,并促进了脑内脂质代谢和神经退变性疾病关系的研究。为研究人在脂质代谢和早老性痴呆等疾病中的作用,我们从突变基因入手,建立了近交系转基因小鼠模型。该模型的建立不仅可从整体水平上研究基因的多种功能,也为相关疾病的病因学和功能基因的研究,以及评价新的治疗或预防措旌的效果和安全性提供了理想的手段。本论文分为三个部分:一、人突变近交系转基因鼠系和相关疾病模型的建立。首先我们建立了人蚢近交系转基因鼠系,用印迹杂交确定人基因在小鼠体内的整合,得到捉ㄊ只,首建鼠弧2⒎直鸾玊和皇捉ㄊ蠼写ùㄏ怠W;蚴蟮奶逯氐纫话闵镅匦与正常鼠相比没有差异,外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,其遗传特征符合常染色体单位点整合。印迹杂交发现人突变基因可在转基因小鼠中稳定表达,⑾謅转基因鼠的学忆能力,;蚴笥雋转基因鼠杂交,建立了双转基因因鼠的自发变换行为未发生显著改变,尚需继续观察。双转基因鼠血脂水平、学忆能力随年龄增加的变化,老年斑的形成等正在检测中。二、人突变转基因动物基因表达特点的分析。我们通过削减文库的筛选以及微阵列的方法,对转基因小鼠基因表达的特点进行了初步分析。的表达序列标签贕中登录,接受号分别为,,=徊接τ蒙镄畔⒀侄味云浣醒由煲曰竦猛暾颍峁晒地从一个げ獬銎渌砘虻娜蛄校⒂刖璕中周蜘和压科大学博士学位论文
。应用连锁基因同源性比较等电子定位的方法将猨基因定位于距鼠第殖因子等个基因表达下调,其中畆原癌基因俸煜改ド伤厥芴扩增得到的序列结果完全一致。随后我们用同一引物对小鼠基因组欣┰觯测序后发现基因组蛄兄邪型暾膃蛄校眯蛄性贕中做同源性比较后,确证得到了一个差异表达的新基因一』8没虻腸编码区长嗦个氨基酸;基因组全长为,有鐾庀宰雍个内含子,且剪接位点符合剪接规律。,发现ひ籎基因在转基因鼠的脑和肾脏中都呈上调表达。另外,呀隥—吹乃蠩归入一个.,经菘饧焖鞣⑾諵一』是一个在机体中广泛表达的基因,但表达丰度各不相同,以肾脏表达相对较高,蛋白结构分析显示氨基末端的个氨基酸残基为典型的疏水性信号肽序列,并可能包含有隹缒ぢ菪个丝氨酸磷酸化位点。为进一步研究唬墓δ埽颐枪菇巳诤媳泶镏柿.,分别转染赴/赴驮嘌难9芷交∠赴峁砻鱍见一对细胞的增殖有抑制作用。用同样的方法对,进行了>璕扩增并测序后,发现将向嫌窝由炝,但该序列的端仍有缺失,经序列同源性比较发现该序列与随后报道的神经酰胺肴樘腔转移酶前体基因恢隆6訠难由煳闯晒Γ院蠓⑾,其中包括参与氧化磷酸化、免疫应答、炎症反应、信号传导等诸多过程的基因,表明人基因在转基因鼠体内的作用不是孤立的,而是通过影响其复杂的基因表达调控网络实现的。阵列的实验发现转基因小鼠肾脏的转录因子,原癌基因甿和刃菘说鞍椎龌虻谋泶锷系鳎渲腥橄侔㊣鸵赘械鞍,血浆谷胱甘肽过氧化物酶前体踊扑醂受体捉樗蚀笙赴长因子芴和白介素芴等基因的表达明显上调。而乖5鞍譍等基因的表达明显下调。另外,在削减克隆筛选中还发现过氧化物酶,白细胞介素,核糖体蛋白等基因在转基因小鼠体内表达上调,阵列的实验结果支持了以上结论。表明由于人突变基因的影响,转基中国协和医科大学博貉宦畚
因小鼠体内一些有关生物氧化和炎性细胞因子的基因表达得以加强,而且转基因鼠体内的蛋白质合成可能更为旺盛。以上结果对人突变转基因鼠的基因表达特点进行了初步描绘,这些差异表达基因和新基因的发现为进一步深入研究基因的功能以及相关疾病的发病机理提供了一些新的线索。转基因鼠的种种异常表现可能也正是由于其基因调控网络中的一些基因表达脱离了平衡态而发生的。最后,我们构建了神经细胞特异表达的重组入基因质粒,并获得了稳定表达有人蚢基因的细胞系。该细胞系可用于研究在神经生物学方面的功能,该质粒也为进一步研究更为理想的转基因鼠模型创