文档介绍：中国协和医科大学
博士学位论文
人载脂蛋白(a)基因簇增强子体内检测系统构建
姓名:李庚;张强
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子物学
指导教师:梁植权;刘德培
中文摘要随着人类基因组工程耐瓿桑蠡蜃时代的到来,探索基因组中%的非编码蛄校芯炕虻谋泶锏骺规律在生命科学领域占据着越来越重要的地位。当个体从单个受精卵发育为由亿万个细胞组成的成体,细胞选择性的开启或关闭,增强或减弱特定基因的表达,产生一个有序的由不同组织,处于不同生长发育阶段,不同细胞周期的细胞组成的有机体。这些大相径庭的体细胞,却有着完全一致的基因组一级结构,提示基因的选择性表达调控具有重要的生物学意义。而基因组内的顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用则是构成基因选择性表达调控机制的基础。基因表达调控网络的概念也就应运而生,它旨在从遗传因素和表观遗传因素相互作用的角度,阐述在特定的染色质环境下,细胞内一系列的调控蛋白如何与基因组内一系列的调控序列相互作用,调节和控制特定基因在一系列生命过程中的表达。顺式作用元件作为基因表达调控网络中重要的组成部分,如何在基因组范围内高效地筛选并鉴定其功能是调控网络研究的重要内容。人载脂蛋白琣基因簇是研究真核基因表达调控的良好模型,而且其研究结果对临床有指导作用。升高的血浆脂蛋白,克轿6鲋嘌不囊桓鲋饕NO找中国协和医科大学临床医学专业毕业论文
际酰弥刈槊傅奈坏闾匾煨灾刈樘匦裕诨蜃槟诘奶囟素,而研究表明它的表达水平主要由的表达水平决定。不同个体中,血浆水平的差异有%是由于其分子量的多态性造成的,另外有%是由于基因表达效率的不同所致。基因近端顺式调控元件启动子,,调控着基因的表达。然而,越来越多的证据表明,启动子是一个相对较弱的启动子;而且它本身的多样性不足于说明基因表达的多样性。在转基因鼠的研究中,相对于有大约的启动子上游序列的谏境薬舳枭嫌涡蛄械腨中基因的表达则有严重减少。研究发现位于转录起始位点上游大约的蛐蛄杏性銮孔拥功能。因此,筛选和鉴定基因簇上潜在的重要顺式调控元件,深入探讨在特定的染色质环境下其与反式作用因子之间的相互作用机制,有助于最终阐明基因表达调控网络的内在规律。。经典的过程分为以下三个步骤:性靥婊显谙赴蜃樯希靶片段的两侧为互为非相容性牧街諰序列,它们仅仅间隔区不同;换辉靥隒重,中国协和医科大学临床医学专业毕业论文
本实验首先设计有相应酶切位点的引物,;谥刈槊介导下,交换载体上两种蛄屑涞慕换黄斡氚性靥迳系陌衅发生交换,实现在基因组的同一位点上交换片段的整合。通过导的技术,产生基因组的特定位点,可以在特定的染色质环境下研究调控序列的作用机制,隔离子的功能,染色质的位置效应以及高效表达目的蛋白质等。我们在经典的方法上进行了改进,首先我们采用了互为反向的坏代替经典的,蛄小S捎贚蚅⒎峭耆ɑノ非相容序列,它们之间的重组可导致靶载体和交换载体的删除而降低交换效率。互为反向的坏阒刈榈慕峁歉谋浞较蚨巧境而提高了交换效率;另外,我们在两坏阒溲∮昧薍诤基因进行正,负筛选,融合基因编码两种选择基因:潮霉素磷酸转移酶訦琀有抗性托叵汆奏ぜっ直鸾姓秆『透荷秆。鼓康幕蛭扌栊带额外的抗性基因。基因簇中扩增启动子序列,。线性化质粒,电穿孔转染赴∈焙蠡怀沙泵顾,中国协和医科大学俅惨窖ёㄒ当弦德畚
选择性培养基。天左右挑取赴タ寺。扩增培养后提取基因组蠵检测分析,∩希梢进一步构建交换载体,行脂质体转化,荷秆。魇较赴欠治觯进行基因簇顺式元件饕NT銮孔的筛选和鉴定。同时这也是构建细胞芯片的基础步骤:细胞芯片技术是新近发展起来的一种高通量转化技术,利用反向转化的原理,在芯片上点样赜薪换黄蔚交换载体后,将细胞培养在芯片上摄入外源谛酒脑位检测转化信号,进行大规模的转化分析,从而进行高通量的顺式元件的功能分析。本实验在赴姓闲谢ノ7聪騆位点的靶载体,获得的赴辏勺魑J芴逑赴用于在特定的染色质环境下顺式作用元件的大规模筛选和功能研究。中国协和医科大学俅惨窖ёㄒ当弦德畚
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