文档介绍：华中农业大学博士学位论文植物人工微RNA(amiRNA)表达载体构建的方法学研究及其应用姓名:严红申请学位级别:博士专业:微生物学指导教师:赵斌;马立新201012植物人工微妣~(蛐il州A)表达载体构建的方法学研究摘要人工微RNA(枷ficialmicroRNA,amiRNA)是在天然miRNA前体序列的基础上,按要求替换其中的miRNA及其互补区域,然后在生物体内按照mi对蛆的生物合成途径而形成的外源小RNA分子。锄iRNA的高效、高特异性以及无离靶效应的优点已经在多种植物中被证实,并被公认为是继hpRNAi技术之后的第二代植物基因功能研究工具。尽管如此,由于舭liRNA前体结构的特殊性,人们构建amiI矾A表达载体均过程繁琐且费用昂贵。为了解决这一问题,让amiRNA技术在植物研究中应用更加广泛,本研究建立了三种新颖、简单、高效、低成本、高通量的植物锄iRNA表达载体构建技术:,构建了三个含有相应锄iRNA表达单元的供体质粒pDonor-amiR319aFLcl、,然后通过接合辅助的遗传整合克隆(】唱,MAGIC)方法将锄iRNA表达单元分别转移至植物双元表达载体,、。将三种amiRNA表达载体分别转入拟南芥,Tl代阳性苗均出现了与预期一致的表型;,:同位素32P标记示踪也检测到了转基因拟南芥中锄iR319aFLcl和锄iRl64aE眦的存在。我们利用该方法构建了油菜锄i对峪表达载体180多个,成本大大低于现有的锄iRNA载体构建技术,测序结果分析表明,该方法获得锄iRNA表达单元的一次性成功率在70%以上。(共20bp)的方式,将携带7bp7口cD序列的锄iR319aCHs前体克隆至末端含有13bp妇D序列的载体pD319a-g邱(T);然后通过直观快捷的蓝白斑筛选方式,获得含有供体质粒pD(T).miR39acH8的蓝色重组子;接下来通过MAGIC方法将锄iR319aCH8表达单元转移至植物双元表达载体,获得锄iRNA表达载体p1301(T).miR319aCHs。将锄iR319acHs表达载体分别转入拟南芥,T1代阳性种子出现了与预期一致的表型;,转基因拟南芥中的c凰华中农业大学20lO届博士研究生学位论文基因的表达量不同程度地下降。我们采用该方法构建了水稻amiRNA表达载体40多个,对amiRNA表达单元测序分析表明,该方法获得anliI矾A表达单元的一次性成功率在90%以上。,nliR528Spl¨和miR528Eu‘1的前体序列,设计并合成三组长度为40~50nt的引物(8条/组),每