文档介绍：硕士学位论文
论文题目人 B7-H4-Fc 融合蛋白的制备及
B7-H4 受体表达的检测
邵联波
研究生姓名
顾宗江
指导教师姓名
免疫学
专业名称
肿瘤免疫
研究方向
2013 年 4 月
论文提交日期
人 B7-H4-Fc 融合蛋白的制备及 B7-H4 受体表达的检测中文摘要
中文摘要
B7-H4 分子是近年新发现的一个 B7 家族成员,其与受体结合后通过抑制 ERK、
JNK、p38、AKT 等分子的活性,进而抑制 T 细胞的增殖、活化和细胞因子的产生,
发挥其负性调节的作用。人 B7-H4 分子定位于人染色体 ,由 6 个外显子和
5 个内含子组成,其 mRNA 在淋巴和非淋巴组织中呈广泛性表达,但由于受到转
录后水平的严格调控,B7-H4 蛋白仅在正常组织中呈现微弱的表达。近来的研究
表明,B7-H4 分子在正常人新鲜分离的 T、B 淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞
(DCs)表面均无表达,但可以被体外活化刺激因子诱导表达,研究还发现,B7-H4
分子在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤细胞以及肿瘤相关巨噬细胞中异常
高表达。这些证据都表明在肿瘤微环境中 B7-H4 的表达对肿瘤细胞逃避机体的免
疫监视具有重要作用。目前,B7-H4 分子的受体还未发现,但关于其受体的研究
是目前免疫学研究的热点之一,其受体的发现将会对帮助我们更进一步的了解
B7-H4 分子的作用机制,为临床应用提供一定的理论依据。
本研究旨在通过构建 B7-H4-Fc 融合蛋白的真核表达体系,获得高纯度的
B7-H4-Fc 融合蛋白,利用免疫沉淀法分离 B7-H4 受体,并利用荧光标记的 B7-H4-Fc
融合蛋白检测 B7-H4 受体在不同临床标本中的表达。
一、人 B7-H4-Fc 融合蛋白的表达及其应用研究
【目的】体外克隆扩增人 B7-H4 分子的胞外段基因以及人 Fc 段基因,将其重
组至 pEGZ–Term 真核表达载体,构建表达人 B7-H4-Fc 融合蛋白的基因转染细胞
株并初步研究 B7-H4-Fc 融合蛋白的生物学功能。
【方法】通过PCR的方法体外扩增人B7-H4分子的胞外段基因和人Fc段基因,
并分别克隆入T载体中,双酶切后装入逆转录病毒载体pEGZ–Term中,构建重组真
核表达载体pEGZ–Term/B7-H4-Fc并进行鉴定;与辅助病毒载体用脂质体法共转染
包装细胞293T制备含有重组病毒的培养上清,以其培养上清感染CHO细胞,经
Zeocin筛选出稳定表达B7-H4-Fc融合蛋白的CHO细胞株;通过流式细胞术和
Western Blot检测CHO/B7-H4-Fc转基因细胞株是否构建成功,纯化鉴定B7-H4-Fc
融合蛋白并对其生物学功能进行初步研究。
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中文摘要人 B7-H4-Fc 融合蛋白的制备及 B7-H4 受体表达的检测
【结果】成功构建了pEGZ–Term/B7-H4-Fc重组真核表达载体,筛选并鉴定获
得能稳定高表达人B7-H4-Fc融合蛋白的转基因细胞并分离纯化出了该融合蛋白,
初步检测该融合蛋白具有体外抑制T细胞增殖的作用,并利用该融合蛋白成功的分
离纯化出了B7-H4受体。
【结论】成功的构建了能稳定表达B7-H4-Fc融合蛋白的转基因细胞株,并分
离纯化出B7-H4-Fc融合蛋白,为进一步研究B7-H4分子的生物学功能奠定基础。利
用免疫沉淀的方法,分离出了B7-H4受体分子。
二、检测 B7-H4 未知受体的表达
【目的】利用荧光标记的B7-H4-Fc融合蛋白,检测B7-H4受体在多种细胞表面
的表达。
【方法】以本研究获得的B7-H4-Fc融合蛋白为基础,对其进行异硫氰酸荧光
素(FITC)荧光标记,利用FITC标记的B7-H4-Fc蛋白作为配体,流式细胞术检测
多种不同来源的淋巴细胞上B7-H4受体的表达。
【结果】检测分析发现在来源于扁桃体的部分B淋巴细胞上组成性的表达
B7-H4受体,在活化T细胞和肺癌组织、肺癌转移淋巴结来源的T细胞也表达B7-H4
受体。
【结论】检测到组成性表达B7-H4受体的B淋巴细胞使我们提取B7-H4受体蛋
白进行进一步的研究成为可能。B7-H4受体在肺癌肿瘤组织及其转移淋巴结中T细
胞上的表达,提示T淋巴细胞可能在肿瘤微环境中接受其再教育后,通过表达B7-H4
受体,与肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞等细胞表面的B7-H4分子以及肿瘤微环境中
可溶性的B7-H4分子相互作用,导致T细胞的免疫忽视,帮助肿瘤细胞逃避免疫监
视和抗肿瘤免疫应答。
关键词:协同刺