文档介绍：《分子生物学》实验报告实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】经过本实验学****利用CTAB法从植物组织中提取DNA并经过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。【实验原理】CTAB(十六烷基三***溴化铵)是一种阳离子型去污剂,可溶解细胞膜,在高离子强度下(),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来,再用酚、***仿抽提的方法去除蛋白,最后经乙醇沉淀得到DNA。琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DN***段的常见技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此,在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系,分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快,迁移距离远,由此得到分离。凝胶电泳也能够分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,cDNA)泳动最快,其次为线状DNA(LDNA),最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键,在260nm波长处有特异的紫外吸收峰,其吸收强度与核酸的浓度成正比,这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1OD260相当于dsDNA50μg/mL,ssDNA33μg/mL和ssRNA40μg/mL。能够此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度,还可经过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度,若DNA的A260/,则可能有RNA污染,。【仪器、材料与试剂】一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000μL量程各一支)、100mL或250mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、、PE手套和乳胶手套。二、药品三羟***氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三***溴化铵)、β-巯基乙醇、***仿、苯酚、乙醇、***化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二***四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。三、×CTABbuffer【1】70%乙醇【2】RNaseA(天根)【3】×TBE缓冲液(工作浓度)【4】6×loadingbuffer【5】(赛百盛)(Takara)/***仿(1:1,V/V)【6】【实验步骤】,在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。×CTAB提取液(﹪的巯基乙醇),混匀,65℃水浴30min,每10min颠倒混匀一次。,***仿混合液,混匀。,500rpm室温离心8min(若没离好可重复一次)。(约400μL)。***仿,混匀,11,500rpm离心8min,取上清(约350μL)。,上下颠倒混匀,-80℃放置30min。℃,15,800rpm离心20min,弃上清。%乙醇(预冷)洗涤沉淀2次,上下颠倒几次,不能vortex,7,000g离心3min,弃上清,风干。(含20μg/mLRNaseA),37℃溶解DNA30min。:(1),放入三角瓶中,×TBE缓冲液,置微波炉中加热至完全熔化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液。(2)胶板的制备①取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙),形成一个模具。②将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并在固定位置放好样品梳子。③待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时,,摇匀,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。④室温下静置直至凝胶完全凝固(室温下30-45min),垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中。⑤×TBE电泳缓冲液至电泳槽中,使缓冲液没过胶面