文档介绍：HRP-F1McAbHRP-F1McAb免疫免疫染色染色检查鼠疫菌试验检查鼠疫菌试验甘肃省疾病预防控制中心甘肃省疾病预防控制中心张张宏宏内内容容一一、、材料材料二二、试验、试验方法方法三、报告检验结果三、报告检验结果一一、、材材料料(一)试剂(一)试剂1. HRP-1. HRP-FIMcAbFIMcAb(辣根过氧化物酶标记(辣根过氧化物酶标记F1F1抗原单克抗原单克隆抗体隆抗体):用):,常用应用浓度一般为配制,常用应用浓度一般为ELISAELISA法应用浓度的法应用浓度的2-32-3倍。倍。2. 2. 固定液:柠檬酸固定液:,溶于,溶于75% 75% 乙醇乙醇100ml100ml,,30% 30% HH22OO22 5ml 5ml,具有杀菌、固定标本和消耗内源性酶,具有杀菌、固定标本和消耗内源性酶活性三项作用。活性三项作用。3. 3. 稀释洗涤液:稀释洗涤液: pH pH PBS,含吐温,含吐温-80 -80 %%、小牛血清、小牛血清2 %2 %,升***(,升***(HgClHgCl22)) % %。。4. 4. 底物染色液底物染色液KaplowsKaplows染液:染液:30%30%乙醇乙醇100 ml100 ml,联苯,联苯******-2HCI -2HCI ,, % % ZnSO44··7H7H220 1ml0 1ml,,aC22HH33OO22··3H3H22O O ,,1N 1N NaOHNaOH ,,,按顺序每加一种试剂,充分振,按顺序每加一种试剂,充分振荡使其溶解或充分混匀,荡使其溶解或充分混匀,,过滤,过滤后装在棕色瓶内,室温可长期保存。临用后装在棕色瓶内,室温可长期保存。临用前取前取1 ml1 ml加加3% H3% H22OO22 。。(二)器材(二)器材1. 1. 普通光学显微镜。普通光学显微镜。((盖玻片盖玻片):经清洁液处理过。):经清洁液处理过。二二、试验、试验方法方法(一)标本制备与涂片(一)标本制备与涂片1. 1. 采取标本:按强毒操作程序进行,留足细菌学检采取标本:按强毒操作程序进行,留足细菌学检验标本,及时编号记录。验标本,及时编号记录。2. 2. 细菌培养物制片:细菌培养物制片:((11)液体培养,蘸取菌液,直接涂片。)液体培养,蘸取菌液,直接涂片。((22)菌落,用白金耳蘸取菌落,加稀释洗涤液研成)菌落,用白金耳蘸取菌落,加稀释洗涤液研成菌液,涂片。菌液,涂片。3. 3. 脏器或组织标本制片脏器或组织标本制片((11)压印标本:组织切面轻轻在载玻片上压印。)压印标本:组织切面轻轻在载玻片上压印。((22)剪碎并研磨成糊状,加等量稀释洗涤液研)剪碎并研磨成糊状,加等量稀释洗涤液研磨磨33分钟,移入试管,用等量稀释洗涤分钟,移入试管,用等量稀释洗涤液冲液冲洗乳钵,移入试管,盖胶塞后摇匀。洗乳钵,移入试管,盖胶塞后摇匀。((33)试管外部用消毒液浸泡后,可从强毒实)试管外部用消毒液浸泡后,可从强毒实验室移到弱毒实验室。验室移到弱毒实验室。((44)组织悬液差速离心集菌涂片:组织悬液)组织悬液差速离心集菌涂片:组织悬液500g500g离心离心55分钟,取上清经分钟,取上清经3000g3000g离心离心55分钟分钟后,取沉淀涂片。可提高阳性检出率。后,取沉淀涂片。可提高阳性检出率。4. 4. 标本涂片自然干燥。标本涂片自然干燥。(二)酶免疫染色(二)酶免疫染色1. 1. 对照:同步做阴性对照:同步做阴性、、阳性标本对照。阳性标本对照。2. 2. 固定:用固定液固定固定:用固定液固定1010分钟,流水冲洗分钟,流水冲洗11分钟。分钟。3. 3. 与酶标记物反应:加与酶标记物反应:加HRP-HRP-FIMcAbFIMcAb,置湿盒内,,置湿盒内,室温作用室温作用3030分钟。分钟。4. 4. 冲洗:流水冲洗冲洗:流水冲洗11分钟。分钟。55. . 显色:用显色:用KaplowKaplow染液染色染液染色55分钟,流水冲洗。分钟,流水冲洗。::光学显微镜油镜检查((11)标本染色结果必须与己知阳性、阴性对照)标本染色结果必须与己知阳性、阴性对照相符。相符。((22)按目测染色深浅与着染菌体量分级)按目测染色深浅与着染菌体量分级: : 镜检:无色或仅见微弱染色,染色浅、明显可镜检:无色或仅见微弱染色,染色浅、明显可见,染色清晰,染色浓厚。见,染色