文档介绍：分子生物学实验讲义(硕士研究生试用)【目的要求】掌握动物纽织蛋白质的提取方法。了解动物组织蛋白质提取的原理。【实验原理】由于蛋白质种类很多,性质上的羌异很大,即或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大,且又处于不同的体系屮,因此不可能有一个固定的程序适用备类蛋H质的分离。但多数分离工作屮的关键部分基木手段还是共同的,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液屮,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、***及丁醇等有机溶剂屮。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。蛋白质在不同溶剂屮溶解度的差异,主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例,其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分了结构性质是不同蛋白质溶解养异的内因。温度、pH、离了强度等是影响蛋H质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用,将细胞内蛋白质提取岀来,并与其它不需要的物质分开。但动物材料屮的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化液等)屮,可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质屮的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质,只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物,如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质,最后剩下的就是不溶性蛋白质。蛋片质经细胞破碎后,川水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂,将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物,即得粗提取液。【试剂器材】%NaCl动物纽•织蛋白裂解缓冲液Tris 50mMNaCl 150mMEDTA ImMTritonX-100 1%去氧胆酸钠 %SDS 0」%PMSF/异丙醇储备液lOOmM(174mg/10ml)于・20°C储存・20°C储存的冰块【操作步骤】颈椎脱臼处死小鼠,75%酒精擦拭皮肤,剪开腹部,剪切肝脏组织,,%NaCl(6mL)的平川I■屮。在平JI1L屮剪碎肝脏组织,并转移到匀浆器中。在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液(20UL/2mL)。迅速将2mL预冷的裂解缓冲液加入匀浆器屮,冰浴条件下充分研磨。,于4°C离心(14000rpm,lOmin)。,即为组织蛋白粗提取液。所获蛋白提取液可保存于・2(rc用于后续实验或用考马斯亮蓝等方法进行蛋白质浓度测定后保存备用。【注意事项】在整个制备过稈中使组织始终处于冰浴状态,以防蛋白质的降解。实验二蛋白质的定量(Bradford法)【目的要求】掌握考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质含址的原理和方法。【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋H质浓度是利用蛋白质与染料结合的原理,定最测定微最蛋白质浓度,具有快速、灵敏的特点。考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式:红色和蓝色。当染料与蛋白质结合后由红色转变成蓝色形式。蛋白质与G250的结合是通过范徳华力实现的,并且在一定浓度范围内二者的结合显色符合朗伯•比尔定律。结合后的产物在595nm处具有最大吸收峰,通过对溶液的光吸收测定可获得与其结合蛋H质的量。【试剂器材】考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250lOOmg溶于25mL甲醇屮,加入800mL蒸馅水,再加入100mL85%磷酸,用蒸水稀释至lOOOmL,滤纸过滤。标准蛋白质溶液(lmg/mL):牛血清白蛋白lOOmg,%NaCl至]00mL。3・试管及试管架,吸管。比色计。【操作步骤】一、标准曲线的制备:取5支试管,编号,按下表操作编号1号液2号液3号液4号液5号液标准蛋H质溶液(mL)(lmg/mL)%NaCl(mL)——蛋白质浓度2004006008001000(jig/mL)另取6支试管,编号为0〜5,按下表操作编号0123451号液2号液3号液4号液5号液不同浓度蛋片质溶液(mL)—」」%NaCl(mL)—————考马斯亮蓝试剂(mL)555555蛋白质含量(|Xg)020406080100混匀各管,室温下静置10分钟,于595nm处进行比色。二、 绘制标准曲线:,标准蛋白质含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。三、 测定未知样品蛋白质浓度:测定方法同上,取适量未知样品,使其测定值在标准1111线的直线范围内。根据所测定的A595切值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白质的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度。【注意事项】在考马斯亮蓝试剂加入后的5-20分钟内测定光吸收,因为在此段时间内颜色最稳定。测定屮,蛋白一染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上,实验证明此复合