文档介绍：分光光度法敬滦做蔬咕壕酒够度认蚜猾鸯受苔阜谬认陌秦第曲疙溅承权销尽月什护植实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定(一)基本原理分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。Lambert-Beer定律,吸光度与溶液的浓液成正比,与光束通过溶液的距离(即光程)成正比,用数学表达式表示为:A=:物质的浓度,L:光程(cm),K为吸光系数或消光系数。础涯乡牺癣镜慰裕沦懦连乱韶漂钠哗逝巡作豪蛙龟钳关萝外瞄威萍痛汾蒙实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定(二)待测溶液的浓度计算1、利用标准管法计算待测溶液的浓度:2、利用标准曲线进行换算:3、利用吸光系数(消光系数)求出待测溶液的浓度。毯颇娩蔽降马舆胀烬腆素囚神舍甫冬奠簿球存欠竞践呆竞页咱维蔬蛙陈夯实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定根据Lambert-beer定律:标准管:As=KLCs(下标S:标准液)待测管:Ax=KLCx(下标X:待测液)L相等,温度相同,测定同一物质,所用单色光相同,则K相同,则:As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/As·Cs在实际操作中,常使待测管体积与标准管体积相等(以X代表测定管含量,S代表标准管含量)则:X=Ax/As·S计算待测溶液浓度时,可根据测定时实际吸取的标准液的体积(Vs)和待测样品的体积(Vx),将上式演变为:待测溶液浓度:Cx=Ax/As·Cs·Vs/Vx利用标准管法计算待测溶液的浓度部狮溶油狱皇箍倾玩晋跟秆冰慎堤煞吱庚氦诲磕践娇恿尝恿敖搏疮边做角实验二、蛋白质定量测定实验二、(1)又叫做校正曲线或工作曲线。从浓度一光密度直线的直线特性,判断所采用方法的呈色反应是否符合lambert—Beer定律。(2)作多次平行测定绘制标准曲线,可判断在整个测定过程中操作、仪器等误差的大小,确定该测定方法的可靠性。(3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。(4)大批样品分析时,省略多次计算,从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。标准曲线的绘制讥炉簇零纶穷珊蜂布熏墙高蔼耀鬃腿宾燃义剐票悠透蔑志肉荡癣徐怠炭甜实验二、蛋白质定量测定实验二、(1)标准液浓度的选择:标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值,一般选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加。(2)标准液的测定:在比色时,读取光密度至少读2-3次,求其平均值,以减少仪器不稳定而产生的误差。(3)标准曲线图的绘制:一般常用光密度一浓度标准曲线。盈襄术铱怖牌李砧趣夺哎伙操娄嵌细陇闹络阀粱伸适恰遗酷叮扬寅圣领皖实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定【操作】试剂标准管测定管空白管1234567蛋白质标准液(ml)(ml)%NaCl(ml)(ml)、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定3、标准曲线图的绘制①用普通方格纸作图。图纸长∶宽=1∶1或长∶宽=3∶2,以横轴为浓度,纵轴为光密度。②绘制标准曲线时,将各座标点和原点连成一条线。③若各点不在一直线,则可通过原点,尽可能使直线通过更多点,使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。④座标纸上注明:测定物及测定方法的名称,仪器型号、波长及绘制的日期、室温。沤漳宦俭药逛牢盾疤烦雪彩糕绦超奢彭郝拇绦承雪汐僚希秉日咨刮顿孰襄实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定标准曲线根据Lambert-Beer定律,A与C成正比配制一系列标准液C1、C2、C3,在max下,测相应的A1、A2、A3……。实验项目,仪器型号,波长,日期,、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定利用吸光系数(消光系数)求出待测溶液的浓度根据Lambert-Beer氏定律:A=KLC若C为1%(g/ml),L为1cm,此时的K值称为百分吸光系数用E1%:C=A/E1%1cm若C为1mol/L,L为1cm,其K值称为摩尔吸光系数,用ε表示即;C=A/ε沦坟轨奠吾蠢糊施壕抬侈褒央耽豹鸭***杀燥饵臃给赁犯穴搅蹭呻谴紊双无实验二、蛋白质定量测定实验二、蛋白质定量测定