文档介绍：硕士学位论文燃马耳他布鲁氏菌膜间质蛋白BP26抗原表位筛查与鉴定硕士研究生:丘金浪指导老师:黎诚耀教授摘要背景:布鲁氏茵病(Brucellosis,简称布病)又称地中海弛张热,马耳他热, 波浪热或波状热,是由布鲁氏菌(Brucella,简称布菌)侵入机体后引起的人畜共患传染病。人感染后可引发关节炎、脑膜炎、心内膜炎等,表现为持续性感染且难以治愈。动物感染后可引发公畜睾丸炎和附睾炎,孕畜多数发生流产、早产、死胎等,是造成畜牧业重大损失的主要疾病之一。近年来,该病的发生和流行在世界范围内呈上升趋势。据世界卫生组织(World anization, WHO)统计表明,全球每年有50万例入布病发生,每年造成的经济损失达30 亿美元。根据我国疾病预防控制中心(CDC)的统计显示,我国每年也有35000 例人布菌感染病例。布菌为革兰氏阴性,兼性厌氧胞内寄生菌,无芽胞,无鞭毛,有荚膜。目前布鲁氏菌科可分为9个种属:羊种(),牛种(。tus),猪种(B. suis),沙林鼠种∞.neotomae),绵羊附睾种(B ova),犬种(量can#),团鼠种(B microti),鲸型海洋种()和鳍型海洋种()。我国流行的布病总体上以羊种为主的混合感染,羊种占流行株的85%。布病的预防主要依赖疫苗免疫,减毒活疫苗是目前最为有效的疫苗。,免疫效果比较好。然而,:一是免疫动物与自然感染动物不能区别,严重影响了布病的诊断和检疫;二是疫苗毒力较强,可引起部分孕畜流产。因此,研制一种新型的毒力低、免疫效果好、能进行鉴别诊断的分子标记疫苗势在必行。摘要目前,国内外倾向于采用基因工程的手段对布菌现有疫苗进行改造。 BP26基因缺失株(CGV26)并发现仍具有免疫保护效果。但是,,敲除BP26得到新的突变株M5A切26,其毒力有所下降,但免疫应答弱于原疫苗株,持续时间短,免疫效果达不到要求。由此推断,BP26蛋白可能与疫苗株毒力和保护性抗原相关,,则影响弱毒疫苗株的免疫效果。膜间质蛋白或称周质蛋白BP26(Periplasmic ProteinBP26),又称omp28或 CP28是布菌的一种外膜间质蛋白,在布菌多数亚种中具有高度的保守性。研究表明,BP26蛋白在感染的牛、绵羊、山羊和人中是一种免疫优势抗原,可作为动物和人布菌感染的诊断抗原,准确率可达到86%以上。因此,,针对BP26蛋白抗原表位及毒力相关位点进行分子修饰或改造,构建分子标记的弱毒疫苗株,建立表位 ,进而解决布鲁氏菌疫苗免疫与野生菌株感染的鉴别诊断技术难题。目的: T细胞抗原表位,最终绘制出M5—90主要蛋白抗原表位及其宿主MHC限制性图谱,为M5—90弱毒疫苗株的基因工程改造提供实验数据支持。材料与方法:实验采用基因原核表达技术,(rBP26) 蛋白。以rBP26蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采用鼠脾细胞与骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备BP26单克隆抗体。(NMP)为抗原,采用West Blot和ELISA方法测定制备的单克隆抗体的特性; 以合成的BP26重叠多肽或突变多肽,。,测定筛查出的BP26 表位多肽与抗体的反应性,评价与rBP26一ELISA、(SAT)和虎红平板凝集试验(RBPT)的符合率。采用ELISPOT方法, ,初步筛查BP26 蛋白T细胞抗原表位。结果: 。实验以pET-28a或pET-30a质粒构建了1个表达完整的 rBP26(1-250aa)、()、(48—1 3aa)和 rBP26—)的重组载体,并在大肠杆菌中进行了诱导表达。经超声破碎细菌后的表达蛋白产物包涵体以盐酸胍溶解、复性和纯化,%以上。 。用复性的rBP26抗原分三次免疫BALB/c小鼠,抗原量分别为10099、5099