文档介绍：凝胶电泳技术
电泳(electroghoresis):带电物质在电场中向相反电极移动的现象。
电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶,但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
电泳的基本原理:
在电场中,推动带电质点运动的力(F)等于质点所带净电荷量(Q)与电场强度(E)的乘积。F=QE质点的前移同样要受到阻力(F)的影响,对于一个球形质点,服从Stoke定律,即:F′=6πrην式中r为质点半径,η为介质粘度,ν为质点移动速度,当质点在电场中作稳定运动时:F=F′即QE=6πrην
球形质点的迁移率,首先取决于自身状态,即与所带电量成正比,与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外,电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。
电泳迁移率(m)是指在单位电场强度(1V/cm)时带电分子的迁移速度
迁移率与带电分子所带净电荷成正比,与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。
为了获得好的电泳结果,应尽量减少电荷效应,增加分子筛效应。
常用的凝胶电泳有两类:
琼脂糖凝胶电泳:分辨率稍低,适于较大分子。
聚丙烯酰胺凝胶电泳:分辨率高,适于较小分子。
一、影响凝胶电泳迁移率的因素
(一)样品的物理性质
1、分子大小
线状双链DNA分子长度(碱基对数目bp)的对数(log10)与迁移距离成反比,以此来测定DNA片段(线性双链)的分子量准确且方便。
EB嵌合使迁移率下降15%。
当DNA分子大小超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小,因此,就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时,分子大小不宜超过此值。
2、分子的空间构型:即使分子量相同,构型不同,其迁移率也不同。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大,比如质粒分子,泳动率的大小顺序为:共价闭合环状DNA(covalently close circular c DNA,超螺旋构型) >lDNA(linear form,线型,质粒的两条链均断裂;线性分子)>ocDNA(开环DNA,open circularDNA,ocDNA,它的双链中的一条保持完整的环状结构,另一条单链上有一到几个切口)。
但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况。
3、带电量:核酸分子是两性解离分子,,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负极泳动;-,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同,因此对泳动速度影响不大。
4、碱基组成: 对迁移率影响不明显,单链DNA形成发头结构,影响迁移率,单链(1kb)小于双链DNA(1kb)