文档介绍：设计性实验报告 2012-2013 学年第一学期课程名称: 生物化学题目: 牛血清清蛋白的鉴定院系: 基础医学院班级: 2011 级 k-3 班姓名: 余国清学号: 1120150305 日期: 2012-12-02 实验目的: 通过牛血清清蛋白的提取与鉴定,掌握盐析、离心、透析、电泳、及呈色反应的原理及应用。实验原理: 应用相同浓度硫酸铵反复盐析法,将血清中的清蛋白与其他球蛋白分离,再利用透析法除盐,即可提取清蛋白。再利用电泳技术,即可对牛血清清蛋白进行分离与鉴定。实验步骤: 1. 盐析取离心管一支加入牛血清待测液 2 ml 、加入等量 PBS (磷酸盐缓冲生理盐水) 稀释血清, 摇匀后, 逐滴加入 饱和硫酸铵溶液 4 ml, 边加边摇,然后再 2000 r/min 离心 10 min ,将上清液倒入试管中,留供后面实验用。 2. 透析去玻璃纸( 15cm*15cm ) 一张, 折成袋形, 将前面第一次盐析得到的含清蛋白的上清液倒入袋内,用线绳扎紧上口(注意要留有空隙), 使透析袋下半部浸入盛有半杯蒸馏水中,对蛋白液进行透析,并用玻璃棒搅拌袋外液体,以缩短透析时间。还应经常换水,并用纳氏试剂检查袋外液体的 NH 4 +, 观察颜色变化, 直至袋内 NH 4 + 透析完毕。将袋内液体倒入试管, 既得牛血清清蛋白溶液。 3. 电泳①. 点样取一条 *8cm 膜条,将无光泽面向下,放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透,取出,用干净滤纸吸去多余的缓冲液, 以醋纤膜的无光泽面距一端 cm 处作为点样线,将牛血清样品与待测的牛血清清蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。②. 电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上,放置时无光泽面(即点样面)向下,点样端置于阴极,待平衡 5 min 后,即可通电。用 160 伏电压通电 60 分钟,通电完毕后,用镊子将膜条取出。③. 染色将膜条直接浸于盛有氨基黑 10B 的染液中,染 2 min 取出, 立即浸于漂洗液中, 分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗 5 min , 直至背景漂净为止,用滤纸吸干薄膜。 4. 鉴定比较样品与待测液中清蛋白在薄膜上的电泳结果,比较位置是否一致。预期结果: 如果醋纤膜上的色带位置一致,则说明提取的清蛋白得到了纯化;若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的色带区域,则说明清蛋白的提取不够纯。实验仪器: 名称规格、型号数量说明普通离心机 1 离心血清电泳仪 1 检验清蛋白离心管 2 装盐析血清液醋纤膜 *8cm 1 电泳玻璃纸 15cm*15cm 1 透析清蛋白烧杯 1 透析试管 2 装清蛋白滴管 2 加试剂玻璃棒 1 搅拌比色瓷盘 2 检验 NH 4 + 天平 1 平衡离心管实验试剂: 名称规格、型号数量说明牛血清标准液 2ml 牛血清待测液 2ml PBS 稀释血清纳氏试剂检验 NH 4 + 氨基黑 10B 染色液染色巴比妥缓冲液浸透薄膜漂洗液Ⅰ漂洗漂洗液Ⅱ漂洗漂洗液Ⅲ漂洗硫酸铵 盐析附表: PBS 试剂:用 mol/L 磷酸盐缓冲液( ) 配制的 % NaCl 溶液。 饱和硫酸铵: 用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调到 。漂洗液: 95% 乙醇 45 ml ,冰醋酸 5 ml ,蒸馏水