文档介绍：第一讲体外细胞培养的基本技术?体外细胞培养条件和基本技术?体外细胞培养?体外培养物的生长生物学?细胞系和细胞株?培养物的冷冻与复苏?培养物的污染、检测和排除?一、体外细胞培养条件和基本技术体外细胞培养的优缺点优点:简化细胞的生长环境,方便施加实验因素,便于观测实验结果,便于获得均一细胞群,能够进行大规模生物制品的生产。体外细胞培养不足之处: 培养对象脱离了机体的整体支配和调控, 细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异,分析实验结果时必须考虑这种差异。一、体外细胞培养条件(一)、体外培养实验室 2. 培养室:基本条件要求:清洁、无菌、干燥、不通风,并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 (二)、体外培养的设备和器具设备: ,生物安全柜,净化室 :温度,湿度, pH 值 :去离子水净化装置,石英玻璃蒸馏器, 超纯水装置 :电热干燥箱, pH 计,天平培养器具: : Zeiss 滤器,抽滤式玻璃简易型滤器, 针头式加压塑料小滤器 :( 1)溶液瓶( 2)培养瓶( 3)培养皿( 4)多孔培养板( 5)离心管 :金属筛网(不锈钢网、铜网),尼龙筛网(三)培养用液?水和平衡盐溶液( balanced salt solution, BSS) 水:离子交换水,蒸馏水平衡盐溶液:主要成分: 无机盐和葡萄糖常用 BSS: PBS , Ringer Earle , D-Hanks , Hanks ?培养液: 1. 天然培养液: 1 )血清: 小牛血清, 胎牛血清( fetal bovine serum, FBS ),马血清, 2)水解乳蛋白, 3)胚胎渗出液 :合成培养基的种类 MEM , RPMI 1640 , McCoy 5A , HAM F12 等 : 干粉型培养基的配制: 1).制备高质量的去离子水(玻璃三蒸馏水)或超纯水 2) .加温水至 15-30 ℃之间 3) .加干粉入水中,搅拌令之溶解 4) .加 NaHCO3 5).加水至最终量 6).必要时用 1N HCl 或1N NaOH 调节 pH ,因滤过时 pH 可能受影响 7). 或小于此微孔滤膜滤过消毒?其他用液:消化液等 : 胰蛋白酶、 EDTA 溶液 调整液: NaHCO3 溶液、 HEPES 溶液 :青链霉素常用的生长培养液:基本培养基 80-90 % 血清( 多用小牛血清) 10-20 % 抗生素( 多用青霉素 100 单位/毫升和链霉素 100 微克/毫升一、细胞体外培养的其它条件一)、无污染的气、液相环境: 1、 O2 ( 5%CO2 +95% 空气, O2: 21% ) 2、 CO2- pH 3、液相环境-渗透压二)、温度三)、生长基质 1 、多聚赖氨酸: 2 、纤维连接蛋白: 1mg/ml 3、胶原: 1~3mg/ml 4、层粘连蛋白: 5~10 ? g/ml 一、清洗和消毒 玻璃器皿的清洗:浸