文档介绍：探究山羊的基因克隆实验 1材料与方法试验动物选用5只成年太行青山羊公羊,对其实施阉割手术,采集睾丸组织,放入已处理过的冻存管后投入液氮保存。RNA提取依照说明书操作要求提取山羊睾丸总RNA,通过核酸蛋白测定仪检测纯度、浓度及和,然后琼脂糖变性电泳检测RNA的完整性,贮存于-80℃冰箱。、鼠、牛、绵羊基因同源序列的序列进行分析,在高度保守区域设计扩增序列特异性引物SP1,5’RACE和3’,,引物交由上海生物工程公司合成,试验所用引物序列。基因全长c克隆基因cDNA中间片段克隆使用SYBR?中的反转录反应试剂进行反转录实验,构建10μL反转录体系:.5μL,R;反应条件:。mRNA转录为cDNA后用作后续PCR模板,扩增引物SP1,构建15μL体系:cDNA模板聚合酶;反应条件:94℃预变性个循环;72℃延伸8min。反应结束后1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。和5’RACE扩增以提取的山羊睾丸组织总RNA为模板,严格按照TaKaRa生物公司试剂盒说明进行3’RACE和5’RACE扩增。扩增产物经割胶回收、连接转化、定向克隆至,测序。序列分析分段扩增及RACE获得的山羊基因序列利用DNAStar软件中的SeqMan程序拼接,拼接产物(核酸序列)用DNAStar软件中的EditSeq程序翻译成氨基酸序列。并通过 2结果与分析基因cDNA特异片段及RACE扩增结果本试验从成年太行青山羊睾丸组织提取的RNA进行cDNA第一条链的合成,然后以山羊睾丸cDNA第一链为模板,用R引物进行扩增基因cDNA特异性片段,%琼脂糖凝胶电泳检测,紫外灯下成像分析,观察到一条带,为900bp左右,与预期的目的条带大小相符,说明扩增成功。以合成的RACEcDNA为模板,通过套式PCR反应,3’RACE和5’RACE分别扩增得到约250bp、1000bp的片段(图1),将所得产物进行纯化,与pMD18-T载体连接,转化到感受态细胞,筛选单克隆质粒后送上海生工测序,经结果表明,该序列属于基因3’端和5’端序列。基因cDNA全长序列分析结果cDNA全长序列的获得用DNAS-TAR软件SeqMan程序对RT-PCR和RACE产物测序结果进行拼接分析,山羊cDNA全长序列为,包含有960bp的开放阅读框,编码319个氨基酸。该基因3’非翻译区长87bp,3’非翻译区有真核生物典型的PolyA加尾结构。功能结构域的预测应用SMART服务器分析对结构域功能进行预测,发现在319个氨基酸序列中,73到115之间有一个“pKID”区域,259~316之间含有一个典型的“BRLZ”结构,说明属于bZIP转录因子家族。跨膜区分析用ExPASy提供的在线TM-HMM跨膜区预测软件分析山羊氨基酸序列未发现跨膜区。二级结构的预测通过GOR方法对二级结构预测分析结果如图5显示,山羊蛋白由α-螺旋(%),β-折叠(%)和卷曲螺旋3种模块组成,以α-螺旋和卷曲螺旋为主三级结构预测通过SWISS-MODEL软件在线预测所推导的山羊蛋白三级结构。以PDB数据库中的1kdxB()被选定为模板,%,建模的氨基酸由82~108,